Apoptosis and Expression of Protein TRAIL in Granulosa Cells of Rats with Polycystic Ovarian Syndrome

The relationship between apoptosis of granulosa cells and follicle development arrest in polycystic ovarian syndrome (PCOS) rats, and the contribution of tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) in apoptosis of granulosa cells were explored. By using sodium prasterone sulfate rat PCOS model was induced. The apoptosis of granulosa cells in ovaries of rats was observed by TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL), and the expression of TRAIL protein and mRNA in granulosa cells was detected by using immunhistochemical staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively. The apoptotic rate and the expression of protein TRAIL in granulosa cells were significantly higher in antral follicles from the PCOS rats than in those from the control rats (P<0.01, P<0.05). There was no significant difference in apoptotic rate and the expression of TRAIL protein in granulosa cells of preantral follicles between the PCOS rats and the control rats (P>0.05). No apoptosis and the expression of TRAIL protein in granulosa cells of primordial follicles were found in the two groups. The expression of TRAIL mRNA was significantly stronger in granulosa cells from the PCOS rats than in those from the con- trol rats (P<0.01). It was suggested that the apoptotic rate in granulosa cells was significantly higher in antral follicle from the PCOS rats than in those from the control rats. TRAIL played a role in regu- lating the apoptosis of granulosa cells in PCOS rats.

沉默GATA4对多囊卵巢综合征大鼠模型卵巢颗粒细胞的影响

目的:探讨沉默GATA结合蛋白4(GATA-binding protein 4,GATA4)表达对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠模型卵巢颗粒细胞增殖与凋亡、分泌功能及炎症反应的影响及相关机制。方法:制备PCOS模型,分离培养PCOS模型大鼠卵巢颗粒细胞并将其分为对照组(Ctrl组)、siRNA-NC组、siRNA-GATA4组,检测转染后三组卵巢颗粒细胞细胞中GATA4表达和细胞增殖与凋亡情况,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中激素和炎症因子含量,Western Blotting法检测细胞中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-serine threonine kinase,p-AKT)蛋白表达。结果:siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞增殖率、GATA4、PI3K、p-AKT蛋白表达量较Ctrl组明显减少,细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达量、细胞上清液中雌二醇(estradiol,E2)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、睾酮(testosterone,T)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平较Ctrl组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞增殖率、细胞凋亡率、GATA4、cleaved caspase-3、E2、LH、T、IL-6、IL-1β、TNF-α、PI3K及p-AKT比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:沉默PCOS大鼠模型中GATA4表达,可抑制卵巢颗粒细胞增殖,促进其凋亡,加剧激素分泌异常和炎症反应,其机制可能与下调PI3K/AKT信号通路有关。

雷公藤甲素对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞细胞凋亡及氧化应激的影响

目的:探究不同浓度雷公藤甲素(TP)对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞氧化应激及细胞凋亡的影响。方法:将32只SPF级雌性SD大鼠随机分为4组,即空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,每组8只。TP低、中、高剂量组分别给予60、120、240μg/kg TP腹腔注射,连续14 d。称量大鼠体质量、卵巢湿重并计算卵巢指数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平。苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织形态学,生化试剂盒检测卵巢组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量,二氢乙啶(DHE)染色法检测卵巢组织活性氧(ROS)水平,Western blotting检测芳香化酶(CYP19A1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cle-caspase-3)、核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达情况。细胞实验分为空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,TP低、中、高剂量组人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)分别用20、40、60nmol/L TP处理。采用CCK8法检测细胞活力,ELISA检测细胞上清E2,显微镜观察明场细胞形态,TUNEL染色法检测DNA断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针检测细胞ROS水平,Western blotting检测CYP19A1、Bcl-2、Bax、Cle-caspase-3、Nrf2、HO-1蛋白表达情况。结果:动物实验,与空白组比较,TP中、高剂量组大鼠体质量、卵巢指数明显降低,血清E2和P水平降低,FSH和LH水平升高,闭锁卵泡增多、发育卵泡减少,卵巢组织SOD、CAT酶活力下降,MDA含量增加,卵巢组织ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞实验,与空白组比较,TP处理组KGN细胞活力明显下降,TP中、高剂量组细胞上清E2含量减少,细胞明显出现皱缩、变圆、体积变小等现象,TUNEL阳性表达细胞数增加,细胞凋亡率明显增加,细胞ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:TP能引起显著的卵巢毒性,作用机制可能与氧化应激和细胞凋亡有关。

山茱萸总萜调控伴胰岛素抵抗的PCOS大鼠及其卵巢颗粒细胞分泌作用的机制

目的研究山茱萸总萜调控伴胰岛素抵抗的PCOS大鼠及其卵巢颗粒细胞分泌作用的机制。方法 22日龄雌性SD大鼠皮下注射硫酸普拉睾酮钠9 mg·100g-1·d-1共20 d,伴高脂饮食喂养60 d建立伴IR的PCOS大鼠模型,将PCOS大鼠随机分为模型组和治疗组。治疗组以山茱萸总萜、氯米芬和罗格列酮干预。葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)。放射免疫法测定空腹胰岛素(Fins)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的含量。同时,随机取各组大鼠2只皮下注射PMSG 10 IU/kg,48 h后颈椎脱臼法处死。在无菌条件下迅速剖取卵巢,刺破卵泡,获取卵巢颗粒细胞。光镜观察卵巢形态及颗粒细胞分布,用不同浓度山茱萸总萜、氯米芬和罗格列酮干预培养,检测颗粒细胞对葡萄糖的摄取量和分泌孕激素(P)的量。结果与模型组比较,治疗组大鼠Fins浓度均显著降低(P<0.01),ISI显著升高(P<0.01),T和E2浓度均显著降低(P<0.01),FSH浓度显著升高(P<0.01),大鼠卵巢卵泡内颗粒细胞层数明显增加,孕激素分泌增加(P<0.05),葡萄糖摄取能力增加(P<0.05)。与氯米芬和罗格列酮双阳性对照组相比,无明显区别(P>0.05,P>0.05)。结论山茱萸总萜可改善胰岛素抵抗,细胞葡萄糖摄取,并增加其雌激素和孕酮的分泌。

育肾助孕方对卵巢储备功能降低大鼠卵巢颗粒细胞ERK1/2、JNK1/2蛋白活化的影响

目的:观察育肾助孕方对卵巢储备功能降低(DOR)大鼠卵巢颗粒细胞卵巢组织细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)蛋白活化的影响,初步探讨其作用机制。方法:选择48只雌性SD大鼠随机分为六组:对照组、模型组、补佳乐组和育肾助孕方低、中、高剂量组,每组8只。除对照组以外,其他各组均采用雷公藤多苷药液灌胃构建卵巢储备功能降低大鼠模型。模型组和对照组给予3 ml 0.9%氯化钠水溶液灌胃;补佳乐组采用戊酸雌二醇药液灌胃给药;育肾助孕方低、中、高剂量组大鼠分别采用0.69、1.38、2.76 g/kg育肾助孕方灌胃给药;各组大鼠均每天定时灌胃给药1次,连续14 d。HE染色观察卵巢组织形态变化;Western blot(WB)法检测ERK1/2及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、JNK1/2及磷酸化c-Jun氨基末端激酶1/2(p-JNK1/2)蛋白表达情况。结果:模型组卵巢组织萎缩,卵泡数目及黄体数目减少;补佳乐组、育肾助孕方中、高剂量组卵巢组织形态接近对照组,卵泡及黄体数目较模型组增加;与对照组比较,模型组、育肾助孕方低剂量组p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表达均明显升高(P<0.05),补佳乐组、育肾助孕方高剂量组p-ERK1/2及p-JNK1/2表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,补佳乐组及育肾助孕方各组p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表达均明显降低(P<0.05);与补佳乐组比较,育肾助孕方各组p-ERK1/2及育肾助孕方中、高剂量组p-JNK1/2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);育肾助孕方低剂量组p-JNK1/2蛋白表达明显高于补佳乐组(P<0.05)。结论:大鼠卵巢储备功能降低与p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表达增多有关;育肾助孕方可能通过降低p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白活化,减少卵巢颗粒细胞凋亡,改善DOR大鼠卵巢功能,减缓衰退进程,以中、高剂量组效果较好。

经后增殖方对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞Fas通路的影响

目的研究经后增殖方对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞Fas凋亡通路的影响,探讨中药改善卵母细胞质量的作用机制。方法建立超排卵大鼠模型,30只大鼠随机分为空白组、阳性组和中药组。实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测大鼠卵巢组织中Fas、Fasl、Caspase-8、Caspase-3基因及蛋白的表达。结果阳性组各基因及蛋白表达均增高,与空白组比较差异具有显著性(P<0.05)。中药组各基因及蛋白表达均低于阳性组,其中Fas、Fasl、Caspase-8表达水平与阳性组相比差异具有统计学意义(P<0.05),而Caspase-3表达水平与阳性组无统计学差异(P>0.05)。中药组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论经后增殖方能抑制超排卵大鼠卵巢组织Fas、Fasl、Caspase-8、Caspase-3的表达,抑制颗粒细胞凋亡,推测Fas通路可能是经后增殖方改善卵母细胞质量的作用机制之一。

补肾助孕汤对大鼠卵巢颗粒细胞Smad3、Smad4的作用研究

目的探讨补肾助孕汤对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞生长中Smad3、Smad4的表达作用,为中药复方的研究提供实验数据支撑。方法用生长良好的大鼠颗粒细胞,调整细胞为1×104 cells/1 mL,用24孔细胞培养板,每孔滴入少许培养基,然后放入直径24 mm的盖玻片,让培养液与玻片粘合在一起,每孔再加入细胞悬液37℃5%CO2进行培养,在6 h、12 h、24 h进行观察培养细胞的贴片情况,用免疫组化SP法染色镜检。结果补肾助孕汤各剂量组用药后Smad3、Smad4的阳性率均高于对照组,Smad3:高剂量组用药6 h、12 h、24 h分别与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),中剂量组用药6 h、12 h、24 h分别与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),低剂量组用药12 h高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),各剂量组用药12 h最高,其高于用药6 h、24 h,差异有统计学意义(P<0.05);Smad4:高剂量组和中剂量组用药6 h、12 h、24 h与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),低剂量组用药12 h高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论补肾助孕汤能够促进体外培养的卵巢颗粒细胞的增殖分化,通过促进TGF-β1的含量上调Smad3、Smad4的表达,从而促进卵泡生长发育。

补肾化瘀方对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450表达的影响

目的观察补肾化瘀方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞CYP450蛋白表达的影响。方法运用补肾化瘀方对PCOS模型大鼠进行干预后,采用免疫组化法观察卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达。结果模型组与正常组比较,卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达在表达面积及表达强度上均低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01);补肾化瘀方中、高、低剂量组及妈富隆组用药后,卵巢颗粒细胞的CYP450的蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05);其中补肾化瘀方中剂量对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达效果最佳。结论补肾化瘀方能增强PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达,调节卵巢内分泌失调,改善PCOS高雄血症,逆转卵泡的发育异常,使排卵成功。

益肾疏肝汤含药血清对雷公藤多苷干预的大鼠颗粒细胞凋亡的影响

目的:探讨益肾疏肝汤含药血清对雷公藤多苷干预的大鼠颗粒细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:分离大鼠卵巢颗粒细胞,使用不同含量的肾疏肝汤含药血清以及不同浓度的雷公藤多苷含药血清处理细胞48 h后,使用CCK-8法检测细胞存活率,筛选益肾疏肝汤含药血清和雷公藤多苷含药血清剂量。并将细胞分为正常组(正常培养的细胞)、损伤组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组(雌二醇)。分别采用CCK-8法、TUNEL法、蛋白质印迹法检测细胞增殖、细胞凋亡、凋亡及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:与正常组比较,损伤组细胞增殖、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达均显著受到抑制(P<0.05),而细胞凋亡率、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、裂解胱天蛋白酶-3(cl-caspase-3)蛋白水平均显著增加(P<0.05);与损伤组比较,阳性对照组及中药低、中药中剂量组、中药高剂量组细胞增殖、Bcl-2、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著增加(P<0.05),而细胞凋亡率、Bax、cl-caspase-3蛋白水平均显著抑制(P<0.05);且中药组呈剂量依赖。结论:益肾疏肝汤含药血清可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路,抑制卵巢颗粒细胞凋亡。

益肾疏肝汤对卵巢储备功能减退模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的观察益肾疏肝汤对雷公藤多苷所致卵巢储备功能减退(DOR)模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响,探讨其改善DOR的作用机制。方法32只SD大鼠按随机数字表法分为空白组8只和造模组24只,空白组不予处理,造模组予雷公藤多苷片混悬液50 mg/kg灌胃14 d制备DOR模型,成模后将造模组再随机分为模型组、中药低剂量组和中药高剂量组,每组8只。中药低、高剂量组分别予益肾疏肝汤16.38、32.76 g/kg灌胃,空白组和模型组予等体积生理盐水,连续15 d。观察大鼠动情周期变化,计算卵巢指数和子宫指数,HE染色观察卵巢组织形态,ELISA检测血清抗米勒管激素(AMH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)含量,TUNEL染色检测卵巢颗粒细胞凋亡情况,Western blot检测卵巢组织Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,卵巢指数和子宫指数明显降低(P<0.01),血清AMH、E2含量明显减少(P<0.01),FSH含量明显增加(P<0.01);各级卵泡及成熟卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目增多,卵巢颗粒细胞凋亡率明显增加(P<0.01);卵巢组织Bax、Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.01)。与模型组比较,中药低、高剂量组大鼠动情周期趋于正常,卵巢指数和子宫指数明显升高(P<0.05),血清AMH、E2含量明显增加(P<0.01),FSH含量明显减少(P<0.01);各级卵泡及成熟卵泡数目增加,闭锁卵泡数目减少,卵巢颗粒细胞凋亡率明显减少(P<0.05);卵巢组织Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论益肾疏肝汤能改善DOR模型大鼠病理状态,提高卵巢储备功能,其机制可能与抑制卵巢颗粒细胞凋亡,上调Bcl-2、下调Bax及Caspase-3蛋白表达有关。

CTGF在多囊卵巢综合征中的表达及对卵巢颗粒细胞增殖凋亡的影响研究

目的探讨多囊卵巢综合征中结缔组织生长因子(CTGF)的表达及对卵巢颗粒细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 60只SD大鼠随机分为正常组和实验组,每组各30只。实验组大鼠肌肉注射脱氢表雄酮(DHEA)(6 mg/100 g体重)和0.2 ml的注射用油,正常组大鼠肌肉注射0.2 ml的注射用油。摘取多囊卵巢综合征大鼠模型的卵巢组织,提取组织中的总RNA和总蛋白,Western blot检测CTGF的mRNA和蛋白表达;原代分离培养卵巢颗粒细胞,将NCsiRNA、CTGF-siRNA转染至细胞内,不经任何处理的细胞作为对照组。48 h后CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况;Western blot检测Cleaved caspase3、PI3K、p-AKT蛋白表达。结果卵巢组织中CTGF的mRNA和蛋白表达均显著高于正常组(P<0.01);转染siRNA后能显著降低CTGF的蛋白表达;CTGF-siRNA组细胞存活率及PI3K、p-AKT蛋白表达显著低于对照组和NC-siRNA组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组和NC-siRNA组(P<0.01)。结论 CTGF在多囊卵巢综合征中的表达升高,抑制其表达可降低颗粒细胞的增殖及诱导凋亡,其机制与PI3K/AKT信号通路的调控有关。

Smad3促进大鼠卵巢颗粒细胞自噬

目的探讨Smad3基因对大鼠卵巢颗粒细胞自噬的影响。方法 21d SD雌性大鼠腹腔注射孕马血清20 IU/只,48h后收集卵巢颗粒细胞进行原代培养。培养细胞分为3组:空白对照组:培养液中不加任何处理因素;敲低实验组:培养液中加入Smad3基因特异性的SiRNA及转染试剂RNAiMAX;过表达实验组:培养液中加入Smad3真核表达质粒及转染试剂Lipo 2000。免疫细胞化学方法鉴定培养细胞纯度;Western blotting方法检测Smad3蛋白表达变化,检测转染效率。Smad3基因敲低及过表达后,Western blotting方法检测自噬体膜形成标志蛋白LC3B及自噬调控相关蛋白Bcl-2的蛋白表达变化。结果 Smad3敲低时,LC3B蛋白Ⅱ型与Ⅰ型的比值(LC3BⅡ/Ⅰ)变化不明显,Bcl-2蛋白表达明显降低;Smad3过表达时,LC3BⅡ/Ⅰ明显增加,Bcl-2蛋白表达明显增加。结论Smad3基因特异的SiRNA及真核表达质粒可以有效地转入大鼠卵巢颗粒细胞中,Smad3基因促进大鼠卵巢颗粒细胞自噬,其机制可能与Bcl-2蛋白相关。

骨髓间充质干细胞抑制磷酰胺氮芥诱导的卵巢颗粒细胞凋亡

目的:探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对磷酰胺氮芥(Phosphoramide Mustard,PM)诱导卵巢颗粒细胞凋亡的影响及可能机制。方法:培养雌性Wistar大鼠卵巢颗粒细胞,加入PM诱导凋亡后,与MSCs共培养(MSCs:颗粒细胞分别为1:1,1:5和1:10),Hochest33342、PI双染和DNA-ladder检测凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果:PM可引起颗粒细胞凋亡。与MSCs共培养后,电泳图无明显的梯状带形,凋亡细胞比例下降,细胞存活率上升,差异有统计学意义。Western blot显示,与MSCs共培养后,颗粒细胞Bcl-2表达水平增高,Bax表达水平无变化。结论:MSCs对PM诱导的卵巢颗粒细胞凋亡有抑制作用,其作用机制可能与上调Bcl-2在颗粒细胞中的表达密切相关,为进一步的体内实验及临床应用提供了实验依据。

Genistein对雌性大鼠卵巢颗粒细胞FSHR基因表达的影响

目的观察Genistein对雌性大鼠卵巢颗粒细胞卵泡刺激素受体(FSHR)基因表达的影响,及其与雌激素受体(ER)的关系。方法选取25~28日龄雌性大鼠,皮下注射孕马血清促性腺激素,建立促卵泡发育模型,分离卵巢颗粒细胞进行培养,分别给予Genistein(0、0.1、1、5、10、100μmol/L)及雌激素受体阻断剂ICI182,780(1μmol/L)处理24h后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测芳香化酶基因上游调控因子FSHR mRNA的表达。结果与空白对照组比较,10μmol/LGenistein组FSHR mRNA表达显著增加(P<0.05)。ICI 182,780(1μmol/L)预处理细胞30min后加入1和10μmol/L Genistein,其FSHR mRNA表达分别较1和10μmol/L Genistein组显著下降(P<0.05或P<0.01)。结论10μmol/L的Genistein可上调雌性大鼠卵巢颗粒细胞中FSHR表达,且该作用可能是通过ER介导的。

补肾活血方联合微囊化颗粒细胞移植对大鼠血清FSH、LH及E_2的影响

目的:探讨补肾活方联合微囊化细胞移植技术对大鼠生殖内分泌的影响。方法:将50只SD雌性大鼠随机分成5组:空白组(A组)、去卵巢组(B组)、微囊化GC细胞移植组(C组)、低剂量补肾中药+微囊化GC细胞移植组(D组)、高剂量补肾中药+微囊化GC细胞移植组(E组)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测治疗前后血清雌二醇(E_2)、卵泡刺激素(FSH)及黄体生成素(LH)浓度。结果:微囊化GC细胞移植后,C组大鼠血清E_2水平与B组比较显著升高(P<0.05);FSH、LH水平均明显降低(P<0.01);补肾活血方联合微囊化GC细胞移植后,D、E组E_2水平与C组比较显著升高(P<0.05),FSH、LH水平均明显降低(P<0.05)。结论:与单纯移植微囊化GC细胞相比,补肾活血方联合微囊化细胞移植技术能改善去卵巢大鼠激素分泌状态,其作为临床中医药预防和治疗卵巢早衰的一种手段具有良好的应景前景。

smad4和cyclinA蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达及当归黄芪超滤膜提取物对其的增殖作用

目的:观察smad4和cyclin A蛋白在体外培养大鼠卵巢颗粒细胞中的表达以及当归黄芪超滤膜提取物对其的增殖作用。方法:以不同剂量的当归黄芪超滤膜提取物作用于体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞,用MTS法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞24、48和72小时的增殖情况,并用westren bolt法监测smad4和cyclin A蛋白的表达。结果:smad4和cyclin A蛋白在颗粒细胞高表达,随着细胞增殖作用的增加,其表达也逐渐增加;当归黄芪超滤膜提取物可促进颗粒细胞的增殖,并且呈一定的量效和时效关系,最佳作用浓度为0.375g/L;各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:当归黄芪超滤膜提取物有促进卵巢颗粒细胞增殖的作用,能促进卵泡发育,与上调smad4和cyclin A蛋白表达有关。

miR-23a-3p通过调控靶基因Gja1参与调控大鼠卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡

目的探讨miR-23a-3p在大鼠卵泡闭锁及卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用机制。方法分别在SD大鼠卵巢囊中注射miR-23a-3p模拟物/抑制剂,转染72 h后,采用HE染色法检测大鼠卵巢组织形态变化及闭锁卵泡数变化情况;采用生物信息学及荧光素酶报告系统预测并验证miR-23a-3p的靶基因及其结合位点;体外分离培养大鼠卵巢颗粒细胞,并分别转染miR-23a-3p模拟物及抑制剂,采用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测转染72 h后颗粒细胞中miR-23a-3p及其靶基因缝隙连接蛋白43(Gja1)的表达情况;Gja1干扰慢病毒转染大鼠颗粒细胞,转染72 h后,采用RT-PCR和Western blot检测大鼠卵巢颗粒细胞中Gja1在mRNA和蛋白水平的表达情况;用流式细胞术检测转染miR-23a-3p模拟物/抑制剂、Gja1干扰慢病毒后卵巢颗粒细胞的凋亡情况。结果HE染色结果显示,大鼠卵巢囊注射miR-23a-3p模拟物后卵巢中的闭锁卵泡数量显著增高于模拟物对照组(P<0.05);双荧光素酶报告实验发现,转染miR-23a-3p模拟物组显著降低了荧光素酶活性(P<0.05);RT-PCR结果显示,转染miR-23a-3p模拟物后卵巢颗粒细胞中miR-23a-3p的表达显著增加,Gja1则显著降低(P<0.05),而转染miR-23a-3p抑制剂后对内源性miR-23a-3p和Gja1的表达无显著影响(P>0.05);用Gja1慢病毒干扰载体/对照载体分别转染大鼠卵巢颗粒细胞72 h后,RT-PCR和Western blot结果显示,Gja1干扰组Gja1在mRNA水平及蛋白水平均显著低于对照组(P<0.05);Western blot检测结果显示,转染miR-23a-3p模拟物后卵巢颗粒细胞中Gja1的表达显著降低(P<0.05);流式细胞术检测发现,转染miR-23a-3p模拟物后显著促进了卵巢颗粒细胞凋亡,下调Gja1后卵巢颗粒细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论miR-23a-3p通过调控靶基因Gja1参与调节大鼠卵泡闭锁及卵巢颗粒细胞的凋亡。

补肾调泡周期疗法组方对大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖、分泌及AMH、AMHR2、Smad4表达的影响

目的研究补肾调泡周期疗法组方(逍遥散、三子汤)对大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖、分泌功能及抗苗勒氏管激素(AMH)、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(AMHR2)、Smad同源物4(Smad4)表达的影响。方法6~8周龄SD雌鼠20只随机分为空白组、阳性药物组(7.8 IU·kg^(-1)FSH)、逍遥散组(12 g·kg^(-1))、三子汤组(16 g·kg^(-1))各5只,连续给药4 d后采血,制备含药血清。选取21~25日龄SD雌鼠提取大鼠卵巢颗粒细胞,贴壁生长至70%,用免疫荧光法进行大鼠卵巢颗粒细胞纯度鉴定。培养成功的大鼠原代卵巢颗粒细胞分别用各组含药血清培养液培养,CCK-8法筛选各组含药血清最佳干预浓度;各组采用最佳干预浓度培养细胞,CCK-8法检测各组颗粒细胞24、48、72、96 h增殖情况;ELISA法检测各组颗粒细胞培养液上清AMH、雌二醇(E_(2))及孕酮(P)浓度;Western Bolt法检测各组颗粒细胞AMH、AMHR2和Smad4蛋白表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组颗粒细胞中AMH、AMHR2和Smad4 mRNA表达水平。结果与空白组比较,各组含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖均有促进作用(P<0.05,P<0.01);与阳性药物组比较,三子汤组促进颗粒细胞增殖作用最佳(P<0.01),逍遥散次之(P<0.05);各组颗粒细胞增殖与含药血清干预时间呈正相关,干预48 h启动细胞增殖活性,96 h细胞增殖达到高峰。与空白组比较各组颗粒细胞培养液上清AMH、E_(2)及P的浓度均明显升高(P<0.05,P<0.01);与阳性药物组比较,逍遥散组促P分泌效果更佳(P<0.05)。与空白组比较各组卵巢颗粒细胞AMH、AMHR2、Smad4蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),阳性药物组AMHR2蛋白表达较逍遥散、三子汤组升高明显(P<0.01)。与空白组比较各组卵巢颗粒细胞AMH、AMHR2、Smad4 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),其中三子汤组AMH、AMHR2 mRNA表达明显优于阳性药物组与逍遥散组(P<0.01)。结论补肾调泡周期疗法组方逍遥散、三子汤能促进大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖并与干预时间呈正相关性,促进颗粒细胞分泌甾体激素和AMH,并可能通过上调AMH、AMHR2、Smad4蛋白及mRNA表达,促进卵泡发育和成熟,并以此改善卵巢生殖和内分泌功能。

雷公藤甲素所致的SD大鼠卵巢损伤及淫羊藿苷联合三七总皂苷的干预作用

目的分析雷公藤甲素对SD大鼠卵巢的损伤作用以及淫羊藿苷联合三七总皂苷对卵巢结构和功能的保护作用。方法将18只雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、治疗组各6只,分别以生理盐水、雷公藤甲素50μg/(kg·d)、雷公藤甲素50μg/(kg·d)+淫羊藿苷30 mg/(kg·d)+三七总皂苷组30 mg/(kg·d)灌胃。连续干预6个月后,处死各组大鼠取出卵巢组织,观察卵巢组织病理学变化并进行卵泡计数。取卵巢组织进行原代卵巢颗粒细胞的分离与培养,鉴定细胞后检测卵巢颗粒细胞的活力。结果与正常对照组相比,模型组大鼠卵巢体积变小、结构破坏,闭锁卵泡数量明显增多(P<0.05),成熟卵泡数量减少(P<0.05),卵巢颗粒细胞活力下降(P<0.05)。治疗组的大鼠卵巢结构则未见明显异常,闭锁卵泡数量较模型组减少,卵巢颗粒细胞活力较模型组增强(均P<0.05)。结论雷公藤甲素可损害大鼠卵巢的结构和功能,而淫羊藿苷联合三七总皂苷可部分拮抗雷公藤甲素诱导的卵巢损伤。

左旋十八甲基炔诺酮对大鼠卵巢颗粒细胞和垂体细胞激素合成及分泌的影响

研究了左旋十八甲基炔诺酮对大鼠卵巢颗粒细胞和垂体细胞激素合成及分泌的直接作用。结果显示左旋十八甲基炔诺酮单独作用于无血清培养的颗粒细胞时，抑制雌二醇的合成，但刺激孕酮的分泌；在与促卵泡素合并处理时，颗粒细胞雌二醇、孕酮的分泌量随着左旋十八甲基炔诺酮浓度的增加而增加。利用促性腺激素生物测定方法证明大鼠整体用左旋十八甲基炔诺酮处理后，垂体中促卵泡素和促黄体生成素活性明显下降；同时外周血清中促卵泡素的活性亦下降。培养的垂体单纯用左旋十八甲基炔诺酮处理后，其培养液经生物测定呈现抑制颗粒细胞雌二醇和孕酮的分泌，促性腺激素释放激素可减弱左旋十八甲基炔诺酮的抑制作用。提示左旋十八甲基炔诺酮除通过垂体卵巢轴系起作用外，还能直接作用于卵巢。