近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR突变体酶的稳定性研究

通过蛋白质理性设计和定点突变技术,在近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶wtCpCR的基础上,构建5个突变体酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,考察了有机溶剂、温度、剪切力、氧气、辅酶NADPH浓度对突变体酶的稳定性影响。研究表明,A98 N在磷酸盐(potassium phosphate,PB)缓冲溶液中比酶活力提高10%,而S307 N没有酶活力,其他3个突变体比酶活力均有降低;A98 N和G262 N在PB/甲基叔丁基醚的双相体系中界面稳定性比原始酶wtCpCR分别提高1.7和1.4倍;4个突变体酶的耐热特性略有下降,T_(50)值介于31~36℃;在100、200 r/min条件下,4个突变体耐剪切力均增强,在300 r/min条件下G262 N突变酶的耐剪切稳定性比wtCpCR增强1.3倍;G262 N突变酶在有氧条件下的稳定性更好,比野生酶提高1.4倍,半衰期(t_(1/2))达到11.87 h;辅酶浓度为0~0.4 mmol/L时,G262 N突变酶更加稳定。该研究为该羰基还原酶wtCpCR的多点突变进一步改善酶稳定性提供重要的科学依据,同时可提高该酶在双相体系生物催化工艺的经济性。

酶的耐酸性改造及在赭曲霉毒素A脱除中的应用研究进展

蛋白酶具有催化效率高、专一性强等特点,被广泛应用于食品、化工、医药等领域。但天然蛋白酶易受环境酸度的影响,不适宜的环境酸度会导致其催化效率降低,有效的酶耐酸性改造策略是推动酶制剂工业化应用的关键。理性设计策略可有效提高酶的耐酸性,对不同背景的生物酶可采用同源序列比对、表面电荷优化、分子内作用力优化等策略进行改造。针对赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)暴露较多的食品及食品原料偏酸性的特征,本文综述了酶耐酸性改造的常用策略及其在OTA脱除领域的应用前景,以期为工业酶的耐酸性研究提供参考,为真菌毒素脱毒酶的实际应用提供理论依据。

基于分子结构评价的Bacillus subtilis β-1,4-内切木聚糖酶胰蛋白酶抗性的理性设计

饲料用酶在饲喂过程中,不可避免地会受到消化道中蛋白酶的破坏而令其使用效率受到影响,因此,饲料酶的蛋白酶抗性是其十分重要的性质之一。基于酶反应原理与计算化学理论对Bacillus subtilis 168β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn A)的胰蛋白酶抗性进行理性设计,最终得到三个突变体——Xyn A^(R121C)、Xyn A^(R121C/K98Q)和Xyn A^(K39I)。酶学性质分析显示Xyn A^(R121C)和Xyn A^(R121C/K98Q)与野生型(Xyn A)的最适反应温度均为60℃,Xyn A^(K39I)为40℃;突变体酶与野生型酶的最适p H都是6.0;人工肠液(p H 6.8,10 mg/ml胰蛋白酶溶液)处理野生型及其突变体后,Xyn A^(R121C/K98Q)和Xyn A^(R121C)的残留酶活力均明显比野生型高,它们的半衰期分别是野生型的2.02倍和1.52倍,Xyn A^(K39I)在胰蛋白酶溶液中的半衰期为90min,比野生型缩短了37 min。

基于结构基础的嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌木聚糖酶Cb Xyn10C的热稳定性分子改良

【背景】作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛。来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)的GH10家族木聚糖酶Cb Xyn10C最适温度为85℃,在80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力。【目的】为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶Cb Xyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理。【方法】以Cb Xyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排2种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制。【结果】共获得了4个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优。随着在A45P基础上另外3个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升。获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型分别提高了5℃和6.8℃。分子动力学模拟技术分析发现4个位点的突变引入了新的氢键作用力且优化了疏水作用网络,进而导致酶的结构构象更加稳定。【结论】本研究不仅提高了木聚糖酶在饲料工业中的应用价值,而且对基于酶蛋白结构的稳定性分子改造提供了理论支持。