当归苯酞riligustilide抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应及机制研究

目的研究当归苯酞二聚体riligustilide(DG2)对脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用,并探讨其作用机制。方法通过LPS诱导建立RAW 264.7细胞炎症模型,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法考察DG2对RAW 264.7细胞存活率的影响,Griess法考察DG2对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放炎症介质一氧化氮(nitric oxide, NO)的影响,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)考察DG2对LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌炎症因子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)]的影响,Western blotting法考察DG2对LPS诱导的RAW 264.7细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT)信号通路的影响,免疫荧光法考察DG2对LPS诱导的RAW 264.7细胞STAT3核转位的影响。结果DG2浓度在64μmol/L下对RAW 264.7细胞存活率无影响,DG2能显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO的水平(P<0.001)[IC_(50)=(26.13±5.75)μmol/L],与阳性对照槲皮素的作用相当[IC_(50)=(26.06±2.28)μmol/L];还能够显著抑制炎症因子IL-6和TNF-α的生成(P<0.01,P<0.001)。DG2能够显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS和COX-2蛋白的表达(P<0.01,P<0.001),显著抑制p-STAT3、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和p-p38的蛋白表达(P<0.05,P<0.01),同时抑制STAT3的核转位。结论DG2可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应,其机制可能与下调STAT、NF-κB和MAPK信号通路有关。

荞麦多肽对RAW 264.7细胞氧化损伤的保护作用

为提高荞麦蛋白生物利用度,利用Sephadex G-25凝胶层析和反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离制备荞麦抗氧化多肽(BAPs),对其结构进行表征。通过H_(2)O_(2)诱导RAW 264.7巨噬细胞建立氧化应激模型,评价BAPs对细胞氧化损伤的保护作用。结果表明:经分离纯化得到的BAPs纯度达96.25%,其分子质量为5.8 ku。BAPs对DPPH·、ABTS+·、·OH清除能力及BAPs的还原力以VC当量抗氧化能力(VCEAC)分别表示为(12.12±0.27),(153.82±5.04),(901.95±39.30),(109.23±1.18)μg/mg。在细胞试验中,BAPs质量浓度达200μg/mL时,相较于模型组,对所有测定抗氧化指标均产生显著性(P<0.05)影响,细胞存活率显著提高13.80%,细胞内活性氧(ROS)水平下降40.63%,丙二醛(MDA)含量下降11.92 nmol/mg prog,超氧化物歧化酶(SOD)活力和过氧化氢酶(CAT)活力分别提高23.48 U/mg prot 15.71 U/mg prot。BAPs能有效抵抗RAW 264.7细胞产生的氧化应激反应,为开发荞麦多肽为天然抗氧化剂提供理论依据。

石榴花多糖通过抑制MyD88/NF-κB通路减轻脂多糖诱导小鼠RAW 264.7细胞炎症反应

目的:通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞炎症模型,探讨了石榴花多糖对细胞的抗炎效果及机制。方法:通过CCK8法检测不同浓度的石榴花多糖对小鼠RAW 264.7细胞活性的影响。LPS刺激建立细胞炎症模型,加入250,125,31.25μg/mL石榴花多糖进行处理,24 h后Griess法检测细胞上清液NO水平,ELISA法检测细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE_(2)水平,RT-qPCR法检测细胞iNOS、COX2、MyD88、NF-κB mRNA表达。结果:石榴花多糖的质量浓度在0.25 mg/mL时,细胞存活率下降,在0.125 mg/mL以下时RAW 264.7细胞活力上升。与模型组相比,石榴花多糖组细胞上清液NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE_(2)水平均降低,RAW 264.7细胞的iNOS、COX2、MyD88、NF-κB mRNA表达降低(P<0.05)。结论:石榴花多糖可以抑制MyD88/NF-κB信号通路,降低NO释放和炎症因子水平,进而减轻LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应。

骨髓间充质干细胞通过外泌体对脂多糖诱导的RAW 264.7细胞炎症的抑制作用

目的分析骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)外泌体(mesenchymal stem cells exosome,MSC-Exo)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW 264.7细胞炎症的抗炎作用及其可能的机制。方法从小鼠骨髓提取MSC细胞,通过原代培养方法培养传代。提取并验证间充质干细胞条件培养基(mesenchymal stem cell conditioned medium,MSC-CM)及MSC-Exo对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症的抑制作用。通过LPS刺激RAW 264.7细胞4~6 h后,细胞计数及MTT法检测细胞增殖活性;Western blot检测MSC-CM中的MSC-Exo,电镜观察MSC-Exo形态,纳米粒度仪测定MSC-Exo大小;倒置荧光显微镜观察细胞形态变化;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测LPS诱导的RAW 264.7细胞中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)的mRNA转录水平;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)评估LPS诱导的RAW 264.7细胞中细胞因子IL-6、IL-10的分泌。结果与LPS组比较,MSC-Exo具有抗炎作用,在30 h后LPS诱导的细胞中细胞因子IL-6的分泌显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。MSC-Exo可抑制IL-6 mRNA转录,促进Arg-1 mRNA转录及IL-10表达。结论本研究初步证明了MSC-Exo可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症。

异荭草苷通过MAPK/FoxO信号通路减轻LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应

为了研究异荭草苷(Isoorientin,ISO)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制,将对数生长期的RAW264.7细胞随机分为对照组、模型组(LPS 1μg·mL^(-1))和异荭草苷(ISO 2.5~40μg·mL^(-1)+LPS)给药组。各组细胞培养24 h后,MTT法检测ISO对RAW 264.7细胞毒性,Griess法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量,q RT-PCR方法检测环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达水平,蛋白质印迹分析法测定细胞中COX-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FoxO1和FoxO3蛋白的表达。结果表明,与LPS模型组比较,ISO显著抑制LPS诱导的TNF-α(P<0.001)和NO(P<0.01)的产生,且未见其细胞毒性。此外,ISO以剂量依赖的方式显著抑制RAW 264.7细胞COX-2基因(P<0.001)和蛋白(P<0.05)的表达。蛋白质印迹分析显示,ISO显著抑制MAPK信号通路中p-JNK和p-p38的磷酸化,并减少Fox O1/3的核转位。综上所述,ISO可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应,其作用机制可能与其在MAPK/FoxO信号通路中发挥调节作用有关。

基于PI3K/AKT/mTOR通路的三百棒促进脂多糖诱导的RAW 264.7细胞自噬并抑制炎症

三百棒来源于芸香科植物飞龙掌血Toddalia asiatica(L.)Lam的根,是一种天然土家族中草药,具有抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗微生物等药理活性。其毒副作用小,疗效显著的特点使之成为当前研究热点。许多天然产物已被证明可通过靶向PI3K/AKT/mTOR介导的自噬来抑制炎症及自身免疫性疾病,本项研究通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路来研究三百棒醇提物(Toddalia asiatica alcohol extract,TAAE)对自噬的影响,用脂多糖(LPS)诱导单核巨噬细胞(RAW 264.7)建立炎症模型,通过细胞毒性检测试剂盒检测TAAE对细胞活力的影响,并筛选出药物的浓度及干预时间,透射电镜和单丹磺酰尸胺染色检测巨噬细胞的生物学功能,酶联免疫吸附法检测上清液中相关炎症因子水平,Western blot检测自噬和通路相关蛋白的表达水平;并采用自噬早期抑制剂(3-MA)和通路PI3K激动剂(740Y-P)进一步验证自噬对炎症和信号通路的影响。实验结果表明TAAE可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进自噬泡的形成、自噬体溶酶体融合和降解,降低LPS处理的RAW 264.7细胞中炎性细胞因子的表达和分泌。总体而言,本研究结果为三百棒的抗炎机制的研究提供了新的线索,并为临床更好的应用三百棒治疗炎症性疾病提供理论依据。

不消化性葡聚糖体外酵解液对RAW 264.7巨噬细胞的免疫调节作用

为探究不消化性葡聚糖(indigestible glucans,IGs)体外肠道菌酵解液的免疫调节活性,采用厌氧发酵模型利用健康人体粪便菌群分别对6种IGs(大麦β-葡聚糖、海带多糖、酵母β-葡聚糖、茯苓多糖、抗性淀粉和聚葡萄糖)进行24 h体外酵解,除菌过滤获得IGs酵解液,对pH值和短链脂肪酸含量进行测定。并以RAW 264.7巨噬细胞为研究对象,分为正常组、阳性组和IGs酵解液组,采用CCK-8试剂盒测定细胞活力,一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒测定细胞NO释放量,流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,酶联免疫吸附测定法测定细胞因子分泌量。结果表明,相比于正常组,6种IGs的24 h酵解液均显著提高了RAW 264.7巨噬细胞活力、NO释放量、ROS产生量和小鼠肿瘤坏死因子α分泌量。各IGs 24 h肠道菌酵解液对RAW 264.7巨噬细胞均具有免疫调节的作用。

异甘草素改善RAW 264.7细胞线粒体生物发生抑制LPS诱导的炎症反应

本研究旨在探讨异甘草素(ISL)对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞炎性反应的影响,及其线粒体相关机制。以体外培养RAW 264.7巨噬细胞为研究对象,采用MTT法考察ISL(5,10,20μmol/L)对RAW 264.7细胞活力的影响,Griess法检测NO含量,ELISA法检测TNF-α水平,荧光增强ATP试剂盒检测胞内ATP水平。荧光探针结合流式细胞术检测细胞总体和线粒体源ROS水平以及线粒体膜电势和线粒体质量数。免疫印迹法检测细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及调控线粒体生物发生相关蛋白的表达水平。qRT-PCR检测线粒体生物发生相关基因表达水平。结果表明,LPS成功诱导了炎症模型,ISL能够显著降低RAW 264.7细胞中NO、TNF-α的释放以及显著降低iNOS蛋白水平且呈浓度依赖性,ISL还可显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞内DCFH-DA和MitoSOX荧光强度水平,改善线粒体膜电势以及胞内ATP水平,显著降低由LPS刺激RAW 264.7细胞线粒体质量数的升高。另外,ISL还可改善由LPS诱导RAW 264.7细胞线粒体生物发生和动力学相关蛋白表达水平。本研究证实了ISL可以改善线粒体功能,减轻LPS诱导的炎症反应,提示ISL可以改善由LPS所致线粒体功能障碍。

妇科千金胶囊对LPS诱导RAW 264.7细胞炎症及氧化应激的影响

目的探讨妇科千金胶囊对LPS诱导RAW 264.7细胞炎症及氧化应激的影响。方法采用MTT比色法检测妇科千金胶囊对RAW 264.7细胞活性的影响,Griess法检测细胞上清液NO的浓度,ELISA法检测细胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平,Western blot检测细胞内iNOS、COX-2蛋白表达,DCFH-DA荧光探针检测ROS生成,检测GSH、MDA水平及CAT、SOD、GSH-Px活性。结果妇科千金胶囊可降低NO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平(P<0.05);抑制iNOS蛋白表达的上调,ROS、MDA水平的升高,GSH水平及CAT、SOD、GSH-Px活性的降低(P<0.05),均呈剂量依赖性。结论妇科千金胶囊可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中炎症和氧化应激反应,其抗炎机制可能是下调炎症信号通路中iNOS蛋白表达,减少NO的生成,抑制炎症信号通路下游细胞因子分泌,而并非下调COX-2蛋白表达。

黄精多糖对RAW 264.7细胞活性及炎症因子TNF-α、IL-6、iNOS表达的影响

目的 探讨黄精多糖对RAW 264.7细胞活性及TNF-α/IL-6/iNOS信号通路的调节作用。方法 将RAW 264.7细胞分为正常组和黄精多糖组(31.25、62.5、125、250、500μg/mL),采用CCK8法检测细胞活力。将RAW 264.7细胞分为正常组,LPS(1μg/mL)组,黄精多糖62.5、250μg/mL组,光学显微镜观察形态结构变化,采用ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)水平,高内涵细胞成像技术(HAC)和RT-qPCR法检测细胞中TNF-α、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白和mRNA表达情况。结果 黄精多糖质量浓度小于250μg/mL时,对RAW 264.7细胞活性无明显的抑制作用(P>0.05)。与正常组比较,黄精多糖250、62.5μg/mL组以及LPS组RAW 264.7细胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平升高,细胞中TNF-α、IL-6、iNOS蛋白及mRNA表达也升高(P<0.05,P<0.01)。结论 黄精多糖可通过调控RAW 264.7细胞TNF-α/IL-6/iNOS信号通路的表达,发挥免疫调节作用。

广叶绣球菌中性多糖对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子及TLR2受体的影响

真菌多糖主要通过TLRs受体介导吞噬细胞分泌细胞因子而进行免疫调节作用,为探究广叶绣球菌中性多糖(SNP)对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子的分泌及TLR2受体是否介导此作用,首先采用传统水提法,经HZ-830大孔树脂、DEAE-52和Sepharose CL-6B柱分离纯化后得到SNP,利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定SNP分子质量,利用离子色谱法(IC)和傅里叶红外色谱法(FT-IR)分析单糖组成和结构表征;然后通过MTT比色法分析SNP对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响,以SNP最佳浓度作用,通过酶联免疫吸附测定法检测巨噬细胞RAW 264.7分泌的细胞因子含量;最后通过SNP处理TLR2抗体作用的吞噬细胞,分析TLR2受体是否对SNP调节巨噬细胞RAW 264.7细胞因子的分泌具有介导作用。结果表明,SNP分子质量为3.2×10;u,由摩尔比为6∶12∶63∶10∶5的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成,不含呋喃糖;一定浓度范围内的SNP能显著促进RAW 264.7的增殖,其最佳作用质量浓度为250μg/mL;此浓度下,RAW 264.7的NO、IL-6、TNF-α、IFN-β细胞因子的分泌量最高,与空白对照差异极显著,但均低于脂多糖(LPS)的作用;而加入TLR2抗体后,SNP组巨噬细胞RAW 264.7的上述各细胞因子的分泌量相较未加TLR2抗体组均降低,但除IL-6细胞因子外差异均不显著。由此可见,SNP可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖及细胞因子的分泌,但不是通过TLR2受体介导。

金柑结合多酚的制备及其对RAW 264.7巨噬细胞免疫调节活性

以萃取游离多酚后的金柑果渣为材料,采用高压脉冲电场(PEF)进行处理,提取其中的结合多酚(NEPP)。在单因素(场强、脉冲数和液料比)实验基础上,以金柑NEPP含量为响应值,通过响应面法对金柑NEPP提取条件进行优化;之后应用RAW 264.7巨噬细胞模型,分别采用MTT法、中性红比色法以及Griess法,测定金柑NEPP处理后的RAW 264.7细胞生长情况、吞噬活性和释放NO能力,以评价其免疫活性。结果表明,金柑NEPP的提取工艺回归模型显著,拟合性良好,并预测金柑NEPP含量为1.6728 mg GAE/g DW(即每克金柑干重所含有的没食子酸当量);优化后的PEF提取条件为:脉冲数250次,场强11.8 kV/cm,液料比0.34∶1(L∶g)。在优化条件下,金柑NEPP含量(1.6382 mg GAE/g DW)接近预测值,表明优化后的PEF法提取工艺可用于金柑NEPP的提取。当金柑NEPP质量浓度为100 mg/L时,对RAW 264.7巨噬细胞无毒性作用,可以显著地抑制巨噬细胞NO的分泌水平,并提高其吞噬活性。

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导RAW 264.7细胞IL-1β、IL-6、IL-10表达的影响

目的研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW 264.7细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6及抗炎性细胞因子IL-10的动态变化规律及八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)对其表达的影响。方法 LPS诱导RAW 264.7细胞不同时间(0、3、6、12、24、48 h),在各细胞因子表达高峰的时间点用ELISA及RT-PCR法检测不同剂量(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L)CCK-8对LPS诱导RAW 264.7细胞IL-1β、IL-6、IL-10蛋白及mRNA表达的影响。结果①LPS可诱导RAW 264.7细胞IL-1β、IL-6、IL-10蛋白合成及mRNA表达增加(P<0.05,P<0.01):各细胞因子蛋白的浓度分别于LPS刺激后6、24、24 h达到高峰[分别为(209.41±10.04)、(2 071.64±9.08)、(207.65±16.27)ng/L];各细胞因子mRNA的表达分别于LPS刺激后3、24、24 h达到高峰[分别为(0.723±0.030)、(1.157±0.045)、(0.767±0.035)]。②CCK-8可剂量依赖性抑制IL-1β、IL-6的表达,并使IL-10表达进一步增加(P<0.01),且孵育细胞24 h,CCK-8上调LPS诱导IL-10生成的幅度要大于孵育48 h。结论 CCK-8通过抑制LPS诱导RAW 264.7细胞抑制促炎性细胞因子IL-1β、IL-6的表达和进一步增加抗炎性细胞因子IL-10的表达参与抗炎反应过程。

车前子多糖PSP-B9的结构及抑制RAW 264.7产生NO活性研究

目的:从车前子中分离纯化得到均一多糖(PSP-B9),并研究其化学结构特征及抗炎活性。方法:采用水提醇沉法获得车前子粗多糖,通过阴阳离子交换树脂、离子交换琼脂糖凝胶等柱层析对其进行分离纯化,得PSP-B9;采用高效液相色谱法(HPLC)测定纯度和相对分子质量(M),利用单糖组成分析、部分酸水解等化学方法和UV、傅氏转换红外线光谱(FTIR)等光谱方法分析PSP-B9结构特征,扫描式电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)等方法考察形貌及分子形态;通过体外实验法观察PSP-B9对细菌脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264. 7炎症模型的作用,对抗炎活性进行研究。结果:PSP-B9是纯度较好的车前子均一多糖,相对分子量为7. 69×105Da,由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GluA)、半乳糖醛酸(GalA)、阿拉伯糖(Ara)和岩藻糖(Fuc)组成,物质的量比为3. 21:9. 15:22. 1:10. 92:7. 5:17. 85:61. 35:35. 06;其主链由1,3,6-Man、1,4-Man、1,6-Gal、1,4-Araf、4-Araf、2,6-Gal等组成,1,6-Glc、1,4-Fuc、1,3,4-Rha等位于支链上,由1-Ribf、1-Glc和1-Fuc构成糖链的非还原性末端,是含有糖醛酸和少量蛋白的酸性多糖,分子形态为非晶态固体。PSP-B9能对LPS诱导的RAW264. 7细胞NO分泌有一定的抑制作用。结论:PSP-B9是一个单糖组成丰富,支链较多的结构复杂酸性多糖,具有一定抗炎活性。

热毒宁拆方对RAW 264.7细胞炎症相关因子表达的影响

目的:本研究主要观察热毒宁及其拆方对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7炎症模型分泌促炎因子的影响,探讨热毒宁及其拆方的抗炎作用。方法:体外培养RAW 264.7细胞,热毒宁及其拆方作用于未经刺激的RAW 264.7细胞及LPS(1 mg·L^(-1))刺激后的RAW 264.7细胞,将细胞分为空白对照组、LPS模型组、给药组组,采用噻唑蓝(MTT)法检测不同相对RAW 264.7细胞增殖活力,硝酸还原酶法测定细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E_2(PGE_2)的分泌量。结果:与LPS模型组比较,各提取物组,NO、TNF—α、PGE_2的表达明显降低;3种不同药材提取物之间比较,青蒿对PGE2的抑制作用较为明显,栀子对TNF-α的抑制较为明显,金银花对NO的抑制作用较为明显,且药材提取物之间有协同作用,热毒宁组合对PGE_2、TNF-α、NO的抑制作用最强。结论:青蒿、栀子、金银花提取物均能明显拮抗LPS所致的RAW 264.7细胞炎症反应;不同提取物组合的抗炎作用有差异,热毒宁组合的抗炎作用最强。

金雀异黄素对巨噬细胞RAW 264.7增殖、形态和细胞周期的影响

目的研究金雀异黄素对巨噬细胞RAW264.7增殖、细胞形态及细胞周期的影响,以探讨其对免疫系统的作用。方法以鼠源巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,将金雀异黄素用二甲基亚砜(DMSO)溶解,再用培养液稀释成所需终浓度为12.5、25、50、100μmol·L-1的4组及溶剂对照组(DMSO体积含量比低于0.1%)。通过WST-1细胞增殖实验、倒置相差显微镜及流式细胞仪分别检测金雀异黄素对巨噬细胞的增殖、细胞形态及细胞周期的影响。结果金雀异黄素对巨噬细胞的影响呈时间和剂量依赖关系。50～100μmol·L-1浓度的金雀异黄素作用巨噬细胞24h和48h后均能抑制细胞增殖,细胞增殖率分别为77%～81%、58%～73%(P<0.01);并能影响细胞形态改变,表现为细胞体积增大,并形成较长伪足。流式细胞结果显示,该浓度金雀异黄素可将巨噬细胞阻滞在S-G2/M期。结论金雀异黄素能抑制巨噬细胞细胞增殖,影响巨噬细胞形态,可能与干扰细胞周期有关。

基于NF-κB/MAPK信号通路探讨天山堇菜七叶内酯对脂多糖诱导RAW 264.7细胞的保护作用及机制

目的考察天山堇菜七叶内酯(aesculetin,AESN)对脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)炎症模型的保护作用及机制。方法实验设置空白对照组、LPS模型组、AESN不同浓度(0.16、0.8、4、20μmol·L^(-1))给药组以及对照药吲哚美辛(INDO,10μmol·L^(-1))组,建立LPS诱导RAW 264.7炎症模型。MTS法检测AESN对RAW 264.7细胞毒;Griess法检测一氧化氮(NO)分泌水平;ELISA法检测细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量;qRT-PCR方法检测TNF-α、IL-6、IL-1β,一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达水平;细胞免疫荧光的方法检测iNOS、p-NF-κB p65、IκBα、p-p38、p-ERK1/2蛋白表达;检测AESN对环氧酶1/2(COX 1/2)的抑制活性。结果AESN在0.16、0.8、4、20μmol·L^(-1)可明显抑制LPS诱导RAW 264.7分泌炎症介质NO,抑制iNOS mRNA及蛋白表达水平;降低细胞上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量及mRNA表达水平。AESN还能明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达,抑制IκBα降解,从而抑制p-NF-κB p65发生核转位;还能明显抑制pp38、p-ERK1/2核转位。AESN对COX-1、COX-2具有明显的抑制活性,IC分别为:28.1、2.3μmol·L^(-1)。结论AESN具有较好的抗炎作用,其作用机制与抑制NF-κB/MAPK信号通路有关。

苹果多糖的制备及对脂多糖诱导RAW 264.7细胞凋亡的影响

目的:观察苹果多糖(AP)对脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞凋亡的影响及其机制。方法:采用水提醇沉法从苹果果渣中提取苹果多糖,并测定其糖含量和分子量。采用流式细胞仪考察AP对LPS诱导RAW 264.7细胞凋亡的作用。采用Western Blot法考察AP对LPS诱导RAW 264.7细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果:经水提醇沉法提取纯化得到苹果多糖的糖含量为91.3%,重均分子量为184613 Da。流式细胞仪检测结果显示,LPS诱导RAW 264.7细胞凋亡明显高于正常对照组(P<0.01);与LPS组比较,浓度为0.5 mg·ml^(-1)的AP作用72 h后RAW 264.7细胞凋亡率显著降低(P<0.01),浓度为1.0mg·ml^(-1)的AP作用48,72 h后RAW 264.7细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。Western Blot检测结果显示,与正常对照组比较,LPS诱导RAW 264.7细胞中的Bcl-2蛋白在48,72 h表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与LPS组比较,浓度为1 mg·ml^(-1)的AP作用后,升高了LPS诱导的RAW 264.7细胞Bcl-2蛋白的表达,降低其Bax蛋白的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:AP抑制LPS诱导RAW 264.7细胞凋亡,其机制可能是通过提高RAW 264.7细胞中Bcl-2蛋白的表达,降低其Bax蛋白表达。

白杨素通过MAPK信号抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症

目的:探讨白杨素抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症的分子机制。方法:用不同浓度的白杨素处理RAW 264.7细胞24 h后,CCK-8法检测细胞活力; western blot检测白杨素对LPS诱导的RAW 264.7细胞中MAPK信号蛋白p-ERK、p-JNK和p-P38水平; ELISA法检测TNF-α、IL-6和NO浓度;活性氧探针检测细胞内ROS释放情况。结果:白杨素浓度低于60 mg/L对RAW 264.7细胞增殖无影响; western blot检测表明白杨素抑制了MAPK信号分子p-ERK、p-JNK和p-P38的水平; ELISA结果显示,白杨素抑制TNF-α、IL-6和NO的释放;此外,白杨素也降低了细胞内ROS的产生。结论:白杨素抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应是通过MAPK信号实现的。