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评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型的建立与应用
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作者 马立芝 郭李平 +4 位作者 王立祥 赵志兵 张广州 周冬生 邱业峰 《武警医学》 CAS 2013年第9期796-799,共4页
目的建立评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型,并以此评价副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633株与其重要致病相关基因opaR基因敲除株的毒力。方法以Raw-264细胞为靶细胞,RIMD2210633株及其opaR基因敲除株为效应细胞,通过优化条件,利用Cyt... 目的建立评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型,并以此评价副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633株与其重要致病相关基因opaR基因敲除株的毒力。方法以Raw-264细胞为靶细胞,RIMD2210633株及其opaR基因敲除株为效应细胞,通过优化条件,利用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay建立细胞模型。结果以5倍于靶细胞的菌量感染靶细胞,37℃孵育1.5 h,离心所得上清稀释10倍后,加底物液避光显色10 min,反应条件最佳。opaR基因敲除后,菌株的Raw-264细胞毒性升高,并有统计学差异。结论利用副溶血弧菌标准强毒株RIMD2210633菌株建立了评价副溶血弧菌毒力的RAW-264细胞模型,并利用此平台比较了该毒株与其opaR基因敲除株的毒力,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 细胞毒性 raw-264 opaR
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M-CSF促进RAW 264.7细胞MMP-9的分泌及其可能机制 被引量:6
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作者 王春 许灿新 +3 位作者 彭翠英 秦旭平 李凯 廖端芳 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期947-951,共5页
目的探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)致动脉粥样硬化的作用是否与其影响基质金属蛋白酶(MMP)表达和活性改变有关及其可能机制。方法应用明胶酶图分析方法观察MCSF和(或)PD98059对体外培养的RAW264.7细胞MMP9活性的影响;Westerblot检测M... 目的探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)致动脉粥样硬化的作用是否与其影响基质金属蛋白酶(MMP)表达和活性改变有关及其可能机制。方法应用明胶酶图分析方法观察MCSF和(或)PD98059对体外培养的RAW264.7细胞MMP9活性的影响;Westerblot检测MCSF和(或)PD98059对体外培养的RAW264.7细胞pERK1/2表达的影响。结果MCSF能增强RAW264.7细胞MMP9的活性,并呈一定的剂量依赖性;同时MCSF也呈时间、浓度依赖性促进pERK1/2的表达;PD98059不仅阻断了ERK1/2的磷酸化,而且也降低了MMP9的活性。结论MCSF可诱导RAW264.7细胞MMP9的活性增加,其机制可能与MCSF激活MAPKERK1/2通路有关。 展开更多
关键词 巨噬细胞集落刺激因子 基质金属蛋白酶 细胞外信号调节激酶1/2 动脉粥样硬化 巨噬细胞
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结核分支杆菌Rv2031c慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞凋亡的影响 被引量:4
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作者 史梦婷 孟露萍 +7 位作者 包海洋 付强 史慧君 王慧勤 张辉 任艳 乔军 陈创夫 《动物医学进展》 北大核心 2015年第5期1-5,共5页
研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP... 研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中,经酶切和测序鉴定后,获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中,转染48h后收集慢病毒,并侵染RAW264.7细胞;侵染48h时收集细胞,用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率;提取细胞总RNA并反转录成cDNA,PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况;同时,使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明,成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP;构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv;感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%,而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%;PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达;Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响,为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。 展开更多
关键词 Rv2031c 慢病毒 RAW264.7细胞 细胞凋亡
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大肠不耐热肠毒素B亚单位佐剂活性相关蛋白的筛选 被引量:2
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作者 刘林 周慧聪 +2 位作者 王秋娟 陈思静 马永平 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1761-1766,共6页
目的通过对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位相互作用蛋白的分析,探讨LTB佐剂活性的分子机制。方法纯化的LTB蛋白和生理盐水分别处理RAW 264.7细胞,pulldown实验分离与LTB有相互作用的蛋白分子,质谱鉴定这些相互作用蛋白;免疫荧光和Western ... 目的通过对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位相互作用蛋白的分析,探讨LTB佐剂活性的分子机制。方法纯化的LTB蛋白和生理盐水分别处理RAW 264.7细胞,pulldown实验分离与LTB有相互作用的蛋白分子,质谱鉴定这些相互作用蛋白;免疫荧光和Western blot分析验证与LTB相互作用蛋白在细胞内的相互作用。结果通过质谱鉴定了25种可能与LTB存在相互作用的蛋白分子,并构建了其相互作用网络图,筛选出可能与LTB免疫调节作用相关的蛋白分子;免疫荧光结果显示神经节苷脂能阻断LTB进入RAW 264.7细胞内,LTB在细胞内与GM130存在相互作用,而Vimentin在生理状态下与LTB不存在相互作用;LTB处理RAW 264.7细胞12 h后,β-actin表达上调,Hspd1表达无变化。结论 LTB佐剂活性的发挥是通过与免疫细胞表面GM1结合,引起内吞,并以小泡的形式到达高尔基体,通过高尔基体的加工。最终通过与Jup结合进而作用于TCF/LEF,引起Bcl-2、IL-6、Runx3等基因表达的变化,发挥促进T细胞和B细胞的增殖分化及活化、分泌细胞因子及免疫球蛋白的作用。 展开更多
关键词 LTB RAW 264.7 相互作用蛋白 免疫 佐剂 内吞
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辐射诱导对小鼠巨噬细胞钙结合蛋白S100A8表达及调控影响的初步研究 被引量:2
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作者 丛悦 饶亚岚 +6 位作者 陈肖华 董波 李峰生 王治东 高荣莲 高玲 罗庆良 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期580-582,共3页
目的探讨辐射诱导后小鼠巨噬细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达情况及其调控机制。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,按处置方法不同分为4组:A组正常培养48h;B组经10Gy射线照射后培养48h;C组用5g/ml LPS培养24h后,更换新鲜培养基继续... 目的探讨辐射诱导后小鼠巨噬细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达情况及其调控机制。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,按处置方法不同分为4组:A组正常培养48h;B组经10Gy射线照射后培养48h;C组用5g/ml LPS培养24h后,更换新鲜培养基继续培养24h;D组经10Gy射线照射后培养24h,然后添加5g/ml LPS继续培养24h。采用RT-PCR及定量PCR方法检测各组细胞S100A8 mRNA表达的变化。分别采用H2O2和喜树碱处理细胞,定量PCR检测S100A8 mRNA表达的变化。构建上游5′端系列报告基因表达载体并转染细胞,采用双荧光素酶法检测报告基因的表达水平。结果经γ射线或LPS刺激后,RAW264.7细胞S100A mRNA表达明显增加,二者联合作用后增加更为明显(P<0.05);H2O2处理后S100A8 mRNA表达增加,而喜树碱处理后其表达没有明显变化。单独经γ射线或LPS刺激后,报告基因的表达无明显变化,而二者联合作用后报告基因表达明显增加(P<0.05)。结论辐射诱导可促进RAW264.7细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达。 展开更多
关键词 辐射效应 RAW264.7细胞 基因 S100A8
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重组大鼠ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser逆转录病毒载体的构建及表达
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作者 杨国红 姬文婕 +2 位作者 周欣 毕莹 李玉明 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期677-679,共3页
目的:构建重组大鼠ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser(ddVEGF-C)逆转录病毒载体,建立稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,并验证其表达。方法:利用PCR从pSecTag-ddVEGF-C中获取大鼠ddVEGF-C基因,克隆到pLPCX逆转录病毒载体,经PCR、双酶切和测序验... 目的:构建重组大鼠ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser(ddVEGF-C)逆转录病毒载体,建立稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,并验证其表达。方法:利用PCR从pSecTag-ddVEGF-C中获取大鼠ddVEGF-C基因,克隆到pLPCX逆转录病毒载体,经PCR、双酶切和测序验证,转染PT67包装细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达目的基因的包装细胞株,用反转录PCR(RT-PCR)和Western blot方法验证其在RAW 264.7细胞中的表达。结果:构建的pLPCX-ddVEGF-C逆转录病毒载体经双酶切和PCR鉴定正确,测序结果与ddVEGF-C序列一致,病毒滴度为2×107CFU/mL,RT-PCR和Western blot结果提示重组病毒感染RAW264.7细胞能正确表达ddVEGF-C。结论:成功构建了pLPCX-ddVEGF-C逆转录病毒载体,并建立了稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,为以VEGF-C基础的实验研究提供了新工具。 展开更多
关键词 ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser 逆转录病毒载体PT67 pLPCX RAW264.7
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慈菇多糖通过mTOR信号通路提高巨噬细胞功能 被引量:3
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作者 陈洁 吴小南 +1 位作者 杨雪帆 黄芳 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1692-1695,共4页
目的探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在慈菇多糖提高RAW 264.7巨噬细胞功能中的作用。方法体外培养RAW 264.7巨噬细胞,分别用ELISA和Griess法检测不同剂量慈菇多糖(5、50、500μg/m L)和香菇多糖(100μg/m L)对巨噬细胞分泌... 目的探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在慈菇多糖提高RAW 264.7巨噬细胞功能中的作用。方法体外培养RAW 264.7巨噬细胞,分别用ELISA和Griess法检测不同剂量慈菇多糖(5、50、500μg/m L)和香菇多糖(100μg/m L)对巨噬细胞分泌白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)的影响;用RT-PCR和Western blot检测各组巨噬细胞mTOR/第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)mRNA和蛋白表达变化。结果与对照组比较,慈菇多糖低、中、高剂量组,香菇多糖组巨噬细胞内IL-2含量[分别为(68.216±1.609)、(70.850±6.669)、(89.634±8.399)、(84.367±8.165)pg/m L]上升;慈菇多糖中、高剂量组,香菇多糖组巨噬细胞内TNF-α含量[分别为(46.989±7.895)、(70.739±7.452)、(48.125±6.757)pg/m L]上升,慈菇多糖高剂量组巨噬细胞内NO值[为(7.199±1.242)μmol/L]上升,差异均有统计学意义(均P<0.01);慈菇多糖中、高剂量组RAW 264.7细胞mTOR mRNA表达低于对照组(P<0.05);慈菇多糖高剂量组、香菇多糖组mTOR蛋白表达低于对照组(P<0.05)。结论慈菇多糖可能通过mTOR相关信号通路提高巨噬细胞功能。 展开更多
关键词 慈菇多糖 RAW 264.7细胞 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)
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In vitro anti-inflammatory effects of different solution fractions of ethanol extract from Melilotus suaveolens Ledeb 被引量:4
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作者 ZHANG Xiao-yu TAO Jun-yan +5 位作者 ZHAO Lei HUANG Zhi-jun XIONG Fu-liang ZHANG Shu-ling LI Chong-ming XIAO Fei 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2007年第22期1992-1998,共7页
Background Melilotus suaveolens Ledeb (M. suaveolens Ledeb) has long been used as a folk medicine in inflammation-related therapy. This study was undertaken to determine the anti-inflammatory effect of the plant. Me... Background Melilotus suaveolens Ledeb (M. suaveolens Ledeb) has long been used as a folk medicine in inflammation-related therapy. This study was undertaken to determine the anti-inflammatory effect of the plant. Methods Petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction, n-butanol fraction, aqueous fraction were obtained from ethanol extract of M. suaveolens Ledeb and evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). While dexamethasone (DM) was used as a positive control, the effects of different solution fractions of ethanol extract on tumor necrosis factor α (TNF-α) mRNA, cyclooxygenase 2 (COX-2) mRNA, COX-2 and nuclear factor KB (NF-KB) of LPS-stimulated RAW 264.7 cells were studied by real-time PCR, Westem blot analysis and immunocytochemical assay, respectively. Results Coumarin was one of the main ingredients in different solution fractions of ethanol extract except the aqueous fraction with no inflammatory effect. The petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction and n-butanol fraction of ethanol extract could inhibit the production of TNF-α mRNA, COX-2 mRNA and NF-KB to some extent. Conclusions Different solution fractions of ethanol extract from M. suaveolens Ledeb had similar anti-inflammatory effect as did dexamethasone except the aqueous fraction. Coumarin was likely to be essential to the anti-inflammatory effect, and other ingredients might attribute to their different anti-inflammatory effects from the HPLC fingerprint. 展开更多
关键词 Melilotus suaveolens Ledeb high performance liquid chromatography fingerprint ANTI-INFLAMMATORY RAW 264. 7 cells
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