少阳主骨方对食蟹猴自然退变膝关节骨性关节炎模型p16/Rb信号通路的影响

目的根据中医"少阳主骨"理论,研究少阳主骨方延缓关节软骨细胞衰老和退变的作用机制。方法通过X线选取13只膝关节退变的老年食蟹猴作为动物模型,随机选取1只进行病理学观察,其余食蟹猴随机分为少阳主骨方组、氨糖美辛组、生理盐水组,每组4只,连续灌胃8周后处死所有食蟹猴,对关节软骨进行病理学观察,RT-q PCR、Western-blot检测关节软骨中p16、Rb基因与蛋白的表达。结果老年食蟹猴KOA模型关节软骨病理改变符合KOA病理变化特点,三组食蟹猴Mankin评分少阳主骨方组(7.5±0.53)分、氨糖美辛组(7.75±0.71)分、生理盐水组(8.25±0.46)分,少阳主骨方组与生理盐水组间具有统计学差异(P<0.05);p16基因与蛋白的表达少阳主骨方组<氨糖美辛组<生理盐水组,具有统计学差异(P<0.05);Rb基因与蛋白的表达少阳主骨方组>氨糖美辛组>生理盐水组,具有统计学差异(P<0.05)。结论少阳主骨方可以通过p16/Rb途径延缓关节软骨细胞衰老,从而延缓关节软骨退变。

BRD7调控Rb/E2F通路的分子机制研究

BRD7是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新的Bromodomain基因,过表达BRD7可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期进程,同时发现BRD7基因可以调控Rb/E2F通路的活性.该研究旨在进一步探讨BRD7调控Rb/E2F通路的分子机制.通过蛋白质印迹和RT-PCR实验方法发现,BRD7能够降低Rb的磷酸化水平,抑制cyclinD1、cyclinE的蛋白质表达,上调CDK4抑制子P19的mRNA表达,但对CDK4和CDK2的蛋白质表达没有明显影响;通过荧光素酶实验从转录调控水平进一步证实了BRD7能够明显抑制cyclinD1启动子活性;采用反义核酸技术抑制COS7细胞内源性BRD7的表达后,发现cyclinD1、cyclinE、磷酸化Rb的蛋白质表达水平上调,并且可以促进细胞生长.这些结果表明:BRD7参与调控Rb/E2F信号通路中重要靶分子的表达,抑制Rb/E2F通路的活性,从而阻止细胞周期G1-S期进程,抑制鼻咽癌细胞生长.

灵芝miRNA对人皮肤成纤维细胞衰老的作用研究

为探究灵芝中miRNA对细胞衰老的干预作用及影响,利用过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts,HSF)构建了细胞衰老模型,将灵芝特有的miRNA Glu-miR-01和Glu-miR-03转染HSF衰老细胞,分析细胞衰老相关氧化应激指标,并通过Western blotting检测衰老相关蛋白表达水平的变化。结果显示:构建HSF细胞衰老模型的最适条件为H_(2)O_(2)浓度0.8mmol/L,诱导时间3h;Glu-miR-01和Glu-miR-03均能促使衰老细胞中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)水平上升,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量下降,细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence associated-β-Galactosidase,SA-β-gal)染色阳性率降低,线粒体膜电位升高;衰老信号通路中P53、P21和P16蛋白的表达显著降低,Rb蛋白表达显著升高。该结果表明灵芝中Glu-miR-01和Glu-miR-03对HSF衰老细胞具有保护作用,并对衰老相关的p53/p21/Rb信号通路具有调控作用,为阐明灵芝miRNA对细胞衰老的分子作用机制提供了理论依据。

GSK3β对骨肉瘤细胞增殖的影响

目的研究糖原合成激酶3β（GSK3β）在骨肉瘤细胞增殖中的作用及其分子机制。方法通过Western blot法和NIRKA法，检测正常成骨细胞hFO及骨肉瘤细胞中GSK3β的表达和活性；使用两种GSK3β小分子抑制剂处理骨肉瘤细胞，检测GSK3β活性受抑制下骨肉瘤细胞增殖率和凋亡率；通过GsK38siRNA降低内源性GSK315表达，Western blot法检测p27及其下游eyclinDl-CDK-Rb通路因子的蛋白表达及磷酸化蠖苣立骨肉瘤细胞荷瘤小鼠模型，分别给予DMSO作为对照，以及GSK3抑制剂SB216763、AR-A014418，每周3次腹腔给药，观察肿瘤生长和裸鼠的体重变化情况。结果与正常人成骨细胞相比，骨肉瘤细胞中存在GSK3超表达及活性调节异常；内源性GSK3活性受抑制后抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞的惆亡；降低内源性GSK3活性，肿瘤体积与对照组比较，SB216763，AR-A014418组肿瘤增长受到抑制，有统计学意义（P〈0．05）；降低骨肉瘤MG-63细胞内源性GSK3蛋白表达，使p27蛋白表达水平明显上调，Rb及其在S780、795部位的磷酸化水平下降，CDK2、4、6蛋白水平降低，cyclinDl的表达上调但其磷酸化水平没有影响。结论GSK3β通过对p27及cyclinDl-CDK-Rb径路的调节促进骨肉瘤细胞的增殖，可能为骨肉瘤的临床治疗开辟一个潜在的靶点。

CHD5对肺腺癌细胞增殖、凋亡及p16^(INK4a)/RB通路的影响

目的:探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)在肺腺癌(LUAD)中的临床意义及对LUAD细胞增殖、凋亡和p16^(INK4a)/RB通路的影响。方法:通过UALCAN、K-M数据库分析CHD5在LUAD中表达情况及其与预后的关系;通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测LUAD组织、癌旁组织和各细胞系(H1299、H1650、H1975、A549)及正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中CHD5的表达情况;免疫组化染色检测LUAD组织中CHD5的表达情况,并分析其与患者临床病理特征及预后的关系。CHD5基因的sgRNA载体感染H1975和A549细胞作为过表达组(CHD5-OE组),同时设置空载体感染细胞为阴性对照组(Ctrl-OE组)、未感染病毒细胞为空白组(NC组),并通过CCK-8实验、克隆形成实验、TUNEL凋亡实验、细胞划痕和Transwell实验,评估CHD5表达上调对LUAD细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响,Western blotting实验检测CHD5表达上调对p16^(INK4a)/RB介导的信号通路和细胞周期蛋白表达情况的影响。结果:生物信息数据库分析显示CHD5在LUAD中显著低表达,且CHD5低表达与更差的总生存时间(OS)显著相关;qRT-PCR和Western blotting检测发现,CHD5在LUAD组织和癌细胞(H1299、H1650、H1975、A549)中表达水平均显著低于癌旁组织和正常肺上皮细胞系BEAS-2B,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,65.7%的LUAD组织样本中CHD5呈低表达或不表达,与临床分期、肿瘤直径及淋巴结转移显著相关,与年龄、性别、吸烟及远处转移无关;CHD5低表达的患者无进展生存期(PFS)更短;Cox多因素分析显示CHD5表达可作为LUAD患者预后影响因素(P<0.001)。CHD5过表达明显抑制体外细胞增殖、迁移和侵袭;CyclinD1、CDK4、p-RB、MMP-9的表达水平降低,caspase-9、p16、RB的表达水平升高;结论:CHD5在LUAD中表达下调且与患者的不良预后相关,CHD5过表达可抑制LUAD细胞增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能与抑制p16^(INK4a)/RB信号通路活化有关。

银屑病皮损组织中PPIL6基因的下调表达与功能

目的：分析人类脯氨酸异构酶基因PPIL6（ peptidylprolyl isomerase-like 6）在银屑病皮损组织中的表达异常，并研究PPIL6对信号通路及皮肤细胞增殖的影响。方法利用生物信息学方法从已经发表的基因芯片表达谱数据中分析脯氨酸异构酶（ PPIase）家族基因在银屑病皮损组织和正常皮肤中的表达差异。通过双荧光素酶报告系统研究PPIL6对Rb信号通路的影响。通过Western印迹研究PPIL6对Rb磷酸化的调控。通过染色质免疫沉淀（ ChIP）研究PPIL6敲降表达后E2 F1与下游基因EZH2启动子结合能力的变化。通过MTT实验检测PPIL6对人永生化表皮细胞HaCat增殖能力的影响。结果 PPIL6在银屑病皮损组织中下调表达， PPIL6过表达能够激活Rb信号通路，其机制可能是抑制Rb磷酸化。 PPIL6敲降表达上调E2 F1与EZH2启动子的结合。功能实验表明PPIL6过表达抑制HaCat细胞的增殖。结论 PPIL6可能在银屑病的发生发展过程中发挥重要作用。