增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达。方法用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增,使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,切胶回收DNA片段。将其连接入pEGFP-C1,构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定。将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞(HXO-Rb44)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测Rb蛋白的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致。pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现。Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达。流式细胞仪检测结果显示,含Rb94基因的细胞凋亡率为(21.17±0.45)%,明显高于其他组(P<0.05)。结论成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体,并可在真核细胞中有效表达,Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用。

人Rb94基因联合γ-辐射抑制乳腺癌细胞生长的研究

目的构建含有人类视网膜母细胞瘤94基因(Rb94基因)的腺病毒表达载体,研究其联合γ-辐射抑制人恶性肿瘤细胞生长的作用。方法从人类胚胎中提取总RNA,经逆转录得到目的cDNA,用PCR技术扩增目的基因片段,将其连接入载体pENTRTM1A,然后经LR重组再转入到表达载体pAd/CMV/V5-DESTTM中,对重组体进行鉴定。然后联合γ-辐射作用于乳腺癌细胞,观察细胞生长曲线的变化。结果成功构建了含Rb94基因的腺病毒表达重组体并通过鉴定,联合γ-辐射作用于乳腺癌细胞后有更强的抑制效应。结论本实验构建的人Rb94基因重组腺病毒表达质粒是成功的,与γ-辐射联合共同作用于肿瘤细胞有更强的抑制肿瘤细胞生长的作用。

超声微泡介导Rb94联合野生型p53基因对鼠视网膜母细胞瘤的抑制

背景研究表明，野生型p53（wtp53）和Rb94基因对人视网膜母细胞瘤（RB）的生长均有抑制作用，这2个基因是诱导和维持细胞衰老信号通路中重要的参与基因，因此2个基因联合应用是否对RB的生长抑制效果更好是近来关注的问题。目的观察超声微泡介导Rb94联合wtp53基因转染裸鼠RB后对其凋亡的影响。方法将HXO—Rb44细胞悬液种植至40只雌性SPF级BALB／e裸鼠视网膜下腔建立RB动物模型，造模成功的裸鼠按随机数字表法平均分为模型对照组、wtp53质粒组（含wtp53质粒的微泡悬液）、Rb94质粒组（含Rb94质粒）和wtp53＋Rb94质粒组（联合组）（含wtp53质粒及Rb94质粒），其中模型对照组不做任何处理，其他3个组造模后第7天均由鼠尾静脉注入含相应基因的微泡悬液后，每天以0．5W／cm^2。超声波辐照眼球4S，间隔24S，循环2次。转染基因超声辐照7d摘除肿瘤组织，利用半定量逆转录PCR（RT—PCR）法检测肿瘤组织中wtp53mRNA及Rb94mRNA的表达；采用Western blot法检测基因转染的肿瘤组织中wtp53及Rb94蛋白的表达；用免疫组织化学法测定肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达；采用TUNEL法检测基因转染后肿瘤组织的凋亡情况，计算凋亡指数（AI）。结果HXO-Rb44细胞悬液视网膜下腔注射后移植瘤构建的成功率为80％（32／40），常规组织病理学检查提示检测样本的细胞异型性明显。基因转染后7d，模型对照组无wtp53mRNA及Rb94mRNA的表达条带；wtp53组wtp53mRNA相对值为0．65±0．07，wtp53＋Rb94组为0．32±0．02，差异有统计学意义（t=11．743，P=0．000）；Rb94组Rb94mRNA相对值为0．42±0．03，wtp53＋Rb94组为0．23±0．03，差异有统计学意义（t=5．041，P=0．001）。wtp53、Rb94或wtp53＋Rb94转染后，各组可见与转染相应的蛋白表达条带，wtp53＋Rb94组可同时检测到wtp53及Rb94蛋白的表达条带，但模型对照组无任何基因反应条带。免疫组织化学染色表明，wtp53＋Rb94组肿瘤细胞中VEGF阳性反应强度明显弱于wtp53组、Rb94组和模型对照组。wtp53＋Rb94组AI为37．35±2．14，明显高于模型对照组的0．46±0．05、wtp53组的5．05±O．80和Rb94组的6．43±1．02，差异均有统计学意义（t=-34．395、-28．206、-26．006，P〈0．01）。结论超声微泡造影剂可介导双基因联合转染RB移植瘤，且Rb94联合wtp53基因对RB细胞的促凋亡作用较单基因转染增强。