以RdRp酶为例通过蛋白结构比对研究RNA病毒进化历史的方法学探讨

目的以RdRp酶为例探讨病毒蛋白的保守性以及通过蛋白结构比对研究RNA病毒进化历史的可能性。方法从GenBank下载6个病毒科RdRp酶的序列,通过多维尺度分析筛选代表性的序列,使用在线预测工具SwissModel预测三维结构,分别用Dali和Matt软件进行结构两两比对,对比对结果进行聚类分析。筛选的序列同时进行系统发育分析。结果同一病毒科内RdRp酶结构比对的分值一般小于1.0,不同病毒科之间结构比对的分值一般大于3.0。对于同一病毒种,分离自不同年份的病毒蛋白结构相似,病毒蛋白结构的差异性与年份无明显相关性。聚类分析表明同一科病毒均聚在一起,但Dali和Matt得到的不同病毒科之间的进化关系并不完全相同,与系统发育树所揭示的进化关系也不完全相同。结论用现有的结构比对方法研究RNA病毒进化所得到的结果并不一致,与系统发育树的结论也不尽相同。因此,通过蛋白结构比对来研究病毒的进化历史,需要开发新的、更复杂的结构比对算法。

RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)与非编码RNA(ncRNA)调控的研究进展

RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)是一类以单链RNA为模板合成互补RNA链的聚合酶。根据其来源可分为病毒RdRP和细胞RdRP,病毒RdRP对病毒基因组复制及病毒引起的宿主免疫反应有重要作用,宿主细胞RdRP主要参与RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象。越来越多研究证明RdRP的功能与非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)密不可分,本文对病毒RdRP、细胞RdRP与ncRNA调控之间的关系作了较详细的阐述,同时对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)诱发的肝癌机制提出新的观点。

RNA依赖性RNA聚合酶作为抗戊型肝炎病毒药物作用靶点的研究进展

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是造成急性肝炎最常见的原因之一。HEV基因组由5′非编码区、3个开放阅读框(ORF1、ORF2、ORF3)和3′非编码区组成,仅在HEV-1中发现了ORF4,并与ORF1重叠。各种编码蛋白在HEV的复制和感染中发挥着不同的作用,而HEV的复制是由ORF1编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)所介导的。HEV RdRp是由多个蛋白亚基组成的复合酶,具有7个保守基序,这些保守基序在RNA合成过程中发挥核苷酸识别、合成、延伸、修饰和稳定等作用,保证了RdRp的功能,在HEV的复制和转录中起到关键作用。因此,以RdRp作为抗HEV药物作用靶点的治疗方案具有很好的应用前景,是目前药物开发的一种主流思路。目前,已发现利巴韦林、索非布韦、2′-C-甲基胞苷(2CMC)等核苷类RdRp抑制剂和锌、GPC-N114等非核苷类RdRp抑制剂对HEV有较强的抑制作用,可作为潜在的抗HEV药物进行深入研究。笔者对HEV编码蛋白和HEV RdRp的结构与功能进行阐述,总结目前发现的对HEV有抑制作用的RdRp抑制剂,以期为HEV的药物开发提供一种新的思路。

Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。

HCV治疗的新方法：RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染呈世界流行趋势,50%感染者转变为慢性肝炎,部分发展为肝硬化、肝细胞癌,给人类健康带来了极大危害。目前,没有疫苗研制成功,现有的HCV治疗药物普遍存在局限性,或者有一些药物没有发挥应有的作用。因此,开发新型、安全有效的抗HCV药物成为迫在眉睫的问题。NS5B蛋白是HCV复制的核心物质,具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)功能。研发有效的NS5B抑制剂,从而阻断病毒的复制,成为许多科研机构及制药公司的研究热点,有一些NS5B抑制剂已进入临床实验阶段。

RNA依赖的RNA聚合酶的结构特征及其靶向抑制剂的开发

新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸道传染性疾病。自2019年爆发以来,SARS-CoV-2在世界范围内引起大流行,严重威胁人类的生命安全。目前,已有的疫苗尚不能提供完全的机体免疫保护。因此,开发广谱有效的抗病毒抑制剂是当下热门的研究方向。SARS-CoV-2属于RNA病毒,其RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)在不同RNA病毒中具有高度保守性,是抗病毒抑制剂研发的重要靶标。RdRp是RNA病毒复制的核心组成部分,具有典型的右手杯状结构特征。本文重点介绍近年爆发并持续流行的新型冠状病毒RdRp的结构特征,以及靶向抑制剂的研发进展。同时,选取了其它几种有代表性的致病RNA病毒:流感病毒、轮状病毒、人类鼻病毒、丙型肝炎病毒和寨卡病毒,介绍了它们RdRp的结构特征及其靶向抑制剂的开发。本研究比较了抑制剂靶点结构的异同及抑制效果差异,并分析了可能导致该差异的原因。最后,本文总结讨论了目前针对RdRp抑制剂相关研究的瓶颈问题,为未来针对突发性的RNA病毒传染病的抗病毒抑制剂开发提供新思路。

细胞与病毒中的RNA依赖的RNA聚合酶

就细胞与病毒的RdRP的结构及其功能,以丙型肝炎病毒的NS5B蛋白和RNA干扰系统为例,介绍了RdRP的研究进展.

草鱼呼肠孤病毒分离株HZ08基因组L节段的全长克隆与序列分析

从浙江省湖州地区采集发病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)样品,取症状明显病鱼的肝、脾、肾组织,经过滤除菌处理后接种草鱼肾脏细胞(CIK)进行病毒分离。盲传8代,CIK细胞未出现明显细胞病变,但感染细胞固定后经电镜观察发现,细胞质内有大量病毒聚集,病毒无囊膜,近球形,直径约70nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)相似。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,病毒基因组由11个dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征。为了从分子水平上进一步了解该病毒的特性,应用单引物扩增技术获得了该病毒基因组L节段的全长。序列分析结果表明:完整的L1、L2、L3节段分别由3 927、3 870、3 753个碱基对组成,每个节段正链RNA仅含有1个开放阅读框,通过同源性比较,推测分别编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3,其中VP1推测为病毒RNA转录的鸟苷酸转移酶和甲基化酶,VP2为病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp),VP3为病毒NTP酶及解旋酶。3个推测结构蛋白的序列与GCRV 873株的同源性最高,分别为31%、45%、36%,并且具有与其他呼肠孤病毒相同的基序(motif)。各节段都具有相同的5'端和3'端保守序列,即5'-GUAAUUU......UUCAUC-3'。利用RdRp构建系统进化树,HZ08株与水生呼肠孤病毒聚为一簇,但单独列为1支,应为水生呼肠孤病毒属新成员。

HCV NS5B蛋白对HCVRNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp,NS5B蛋白)。以HCV正、负链RNA3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成。结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性。NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响。这样,就合理解释了在HCVRNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题。同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖的RNA聚合酶功能研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory synd,rPoRmReS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种重要猪病毒性传染病,其主要临床特征是母猪繁殖障碍和生长肥育猪呼吸系统疾病,给全球养猪业造成巨大损失。Nsp9是PRRSV的一种非结构蛋白,由于其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)功能,在PRRSV的复制和毒力中发挥着重要作用。Nsp9序列高度保守,并包含T细胞表位,对未来疫苗的开发具有重要意义。Nsp9在PRRSV感染过程中,特别是基因组RNA复制和转录中,成为病毒与宿主蛋白相互作用的中心。本文就Nsp9在病毒遗传变异、病毒毒力、与其他病毒蛋白及宿主蛋白相互作用影响病毒复制、宿主免疫调节、抗病毒药物及疫苗研发等方面的研究进展进行综述。本综述可为PRRSV的防控提供新的思路和策略。

5-氰基-2-硫乙酰芳氨嘧啶酮类DENV NS5 RdRp抑制剂的设计、合成及活性研究

为了筛选新型的抗登革热病毒(DENV)NS5 Rd Rp酶抑制剂,本论文采用分子杂合的方法,基于嘧啶酮类HCV NS5B Rd Rp抑制剂3jc和ZIKV NS5 Rd Rp抑制剂4w的结构,设计合成了一系列5-氰基-2-硫乙酰芳基嘧啶酮化合物。通过MTT法及噬斑法体外抗DENV活性筛选发现其中5个化合物显示了抗DENV活性,其中活性最高的化合物7a’k的抗病毒活性优于阳性对照物利巴韦林(EC50=7.86μmol·L^(-1)vs EC50=18.07μmol·L^(-1)),其余4个化合物与利巴韦林活性相当。最后通过分子对接分析了可能的结合模式,为该类新型DENV NS5 Rd Rp酶抑制剂进一步研究提供了思路。

中蜂囊状幼虫病毒RdRp基因dsRNA干扰的研究

中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSBV RdRp基因为靶标,选取两个干扰区域RdRp-1和RdRp-2,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi实验,通过qRT-PCR检测CSBV RdRp基因的表达情况。实验结果显示:干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录,而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性,当添食2μg dsRdRp-2时,在72 h RdRp基因表达下调了85%,CSBV的衣壳蛋白VP1基因下调表达78%,幼虫死亡率降低60%,表明RdRp基因可以作为RNA干扰的靶标用于CSBV防治,本研究为后期在养蜂场进行蜜蜂病毒病的防治奠定了基础。

龙眼RDRP基因家族的全基因组鉴定与功能预测

为了解龙眼RNA依赖的RNA聚合酶基因(RDRP)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法对龙眼RDRP家族基因成员进行鉴定,并且对其染色体定位、分子进化树、启动子顺式作用元件、蛋白质结构域、蛋白质二级和三级结构、蛋白质互作、可变剪接类型以及在体胚发生过程中差异表达的FPKM值进行分析.结果显示:龙眼RDRP家族基因包括10位成员,分别定位在1、8、9、11、15号共5条染色体上.通过龙眼与拟南芥、水稻构建的进化树分析,将其分为4类,分别为DlRDR1、DlRDR2、DlRDR4、DlRDR6.龙眼RDRP成员启动子包含多种植物激素以及低温、干旱等非生物胁迫的元件.龙眼RDRP家族均含有RDRP保守结构域,其蛋白质家族成员二级、三级结构较为相似,并且与特异性核酸内切酶(DCL)蛋白互作关系密切,同时也与基因沉默蛋白抑制剂3(SGS3)、依赖DNA的RNA聚合酶(NRPD1A)发生互作.不同体细胞胚发生阶段与不同组织部位的可变剪接事件以内含子剪接为主.龙眼体细胞胚不同阶段的表达模式分析中,龙眼RDRP在非胚性阶段显著上调.本研究表明龙眼RDRP家族成员能够响应植物激素的应答并且参与龙眼体胚和不同组织部位生长发育调控.

石蒜碱类衍生物的合成与抗SARS-CoV-2的活性和作用机制研究

本研究设计合成了5种不同结构类型共18个石蒜碱衍生物,在感染HCoV-OC43的H460细胞模型上考察了其抗病毒活性。构效关系结果表明在石蒜碱的6N原子上引入适当的取代基有利于活性的提高。其中,化合物6a表现出较好的活性,半数有效浓度(EC50)和选择指数(SI)值分别为2.36μmol·L^(-1)和16.52。表面等离子共振实验显示6a可能靶向SARS-CoV-2的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的非结构蛋白12(NSP12)亚基,解离常数(KD)值为1.36μmol·L^(-1)。分子对接结果提示6a可能作用于NSP12的类囊病毒RdRp相关核苷酸转移酶(NiRAN)催化中心,与瑞德西韦等拟核苷类药物的作用机制不同。该研究为将石蒜碱类衍生物发展成为一类全新的抗SARS-CoV-2小分子抑制剂提供了科学数据。

中国国内首次发现Nam Dinh病毒

2009～2011年,课题组在深圳市龙岗区的致倦库蚊标本中检测到我国首株Nam Dinh病毒(Nam DinhVirus,NDiV)。本研究通过细胞培养、SYBR Green I实时定量荧光RT-PCR和RT-PCR方法对深圳NDiV的细胞易感性和分子进化特征进行分析。结果发现4批致倦库蚊标本可以引起C6/36细胞病变。4株深圳分离株的SYBR Green I实时定量荧光RT-PCR检测结果均出现"S"型扩增曲线与特异性的熔解曲线。对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因与部分ZmHel1(Zn module+Superfamily 1 Helicase)基因进行扩增均可以在2%琼脂糖电泳显示到目的条带。4株深圳分离毒株的RdRp基因核苷酸和氨基酸序列与越南代表株NDiV(02VN178)的同源性均达99%以上。系统进化树分析表明,4株深圳NDiV株与越南NDiV代表株的亲缘性最近,属于同一个进化分支上。据文献检索表明,本文发现的NDiV为国内首次报道。

中老缅边境蚊虫标本中Nam Dinh病毒的分离和鉴定

2012年在云南省南部中老缅边境地区采集的库蚊中分离到3株病毒（YN12039、YN12040、YN12060）,该病毒只引起C6/36细胞发生病变。负染电镜观察病毒颗粒呈球形,直径60-80nm,有囊膜,表面有刺突。采用RTPCR方法对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp）、HEL1（superfamily 1helicase）、S蛋白（spike protein）基因进行扩增,同源性分析显示3株云南新分离株与Nam Dinh病毒（NDiV）RdRp、HEL1、S蛋白氨基酸序列相似度最高,均为98%以上。系统进化分析结果表明,3株云南新分离株与NDiV的亲缘关系最近,处于同一进化分支。该研究结果丰富了NDiV病毒的信息,对NDiV病毒分子特征、分布区域和物种嗜性等特征提供了数据参考。

四川省Nam Dinh病毒的首次分离鉴定

目的对2015年从四川省西部的甘孜藏族自治州蚊虫中分离到的病毒株SC1502、SC1510进行鉴定并分析其基因特征。方法通过细胞培养的方法对蚊虫标本进行病毒分离,利用Nam Dinh病毒(Nam Dinh virus,NDiV)特异性引物进行逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)鉴定,同时扩增分离株的开放阅读框、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、解旋酶超家族1(superfamily 1 helicase,HEL1)、刺突蛋白(spike protein,S蛋白)基因序列并测序,然后利用Mega Align软件对核苷酸序列和推测的氨基酸序列进行比对分析,利用Mega 7软件绘制系统进化树。结果SC1502、SC1510病毒株能够引起C6/36细胞发生病变,但不能引起BHK-21细胞的病变。同源性分析结果显示,2株四川新分离株与NDiV的RdRp、HEL1、S蛋白的核苷酸和氨基酸同源性最高,分别超过99.4%和97.5%。系统进化分析结果表明,2株四川新分离株与NDiV亲缘关系最近,处于同一进化分支。结论SC1502与SC1510为NDiV,该研究结果丰富了四川省的虫媒病毒病原谱数据库,对相关地区的不明原因疫情分析和调查提供了参考依据。