实时荧光定量PCR技术原理及在食品检测中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种新兴的核酸定量分析技术,与普通PCR定性分析相比,具有简单高效、准确灵敏、实时分析等更多的优势,是一项实用性很强的技术方法。文中主要对实时荧光定量PCR技术的操作原理、荧光类型及其在食品检测和科学研究领域中的应用进行综述。

实时荧光PCR在食源性疾病中的应用

目的:探讨实时荧光PCR快速检测在食物中毒中病原学基因诊断的应用。方法:采用实时荧光PCR检测技术对一起副溶血性弧菌引起的食物中毒患者的粪便和肛拭增菌液进行快速检测,同时采用传统的分离方法和细菌生化鉴定仪的生化鉴定,及日本生研株式会社生产的肠炎溶血性弧菌型别免疫血清(K型别)分型。结果:在这一起食物中毒的患者中,实时荧光PCR检测6份粪便和肛拭增菌液,其中,4份阳性,并从PCR阳性的增菌液中分离到4株副溶血性弧菌K6型。结论:实时荧光定量PCR技术特异性强,灵敏度高,能在采样后数小时内检测到病原菌的DNA,达到快速诊断的目的,在食物中毒的快速诊断上起重要作用。

实时荧光定量PCR技术在食品污染物监测中的应用

目的：建立快速筛查食品中致病性微生物的实时荧光定量PCR技术,了解丽水居民主要消费食品中致病菌污染的状况和程度,考察其在食源性污染监测中的应用。方法：采用国家标准的细菌培养法和实时荧光定量PCR方法对2007年-2008年上半年丽水地区的3大类172份样本进行7个微生物项目的检测,比较两种方法的灵敏度、特异性和准确性。结果：实时荧光定量PCR检测结果与传统检测方法的符合率为100%,除完全符合的21例标本之外,另有26例采用传统方法检测为阴性的标本用实时荧光定量PCR检测显示为阳性。结论：实时荧光定量PCR方法较传统的细菌培养法具有准确性好、灵敏度高、特异性强、检测快速等优点,可以作为食品污染物监测中快速筛查致病性微生物的理想检测方法。

实时荧光定量PCR技术在副溶血性弧菌快速检测中的应用

目的:建立副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法,应用于食品、食物中毒样本的快速检测。方法:食品样本先选择性增菌,取上层液提取DNA,粪样直接提取DNA,用实时荧光定量PCR方法进行检测,并与常规培养法进行比较。结果:用实时荧光定量PCR检测食品54份,食物中毒粪样12份,检测阳性食品21份、粪样9份,检测结果与培养法比较,阳性检出率分别为食品38.9%、31.5%;粪样均为75.0%。结论:副溶血性弧菌的实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点。

实时荧光定量PCR在副溶血性弧菌食物中毒检测中的应用探讨

目的:应用荧光定量PCR方法快速筛检副溶血性弧菌等食物中毒病原菌,以提高检测速度,与GB培养法比较,探讨两法的符合性和应用价值。方法:采用高度特异、敏感的实时荧光PCR作为初筛方法,用GB方法进行细菌分离培养,用ATB对分离到的病原菌进行鉴定。结果:21份食物中毒病人大便标本实时荧光定量PCR检出副溶血性弧菌特异性DNA核酸阳性18份,GB细菌培养检出18株副溶血性弧菌,两法的阳性符合率一致,检出率均为85.71%。结论:能用实时荧光定量PCR检测食物中毒中的病原菌。与GB培养法相比明显缩短检测周期,报告检验结果及时率提高,达到快速、及时的目的,在食物中毒事件中能更及时查明病因,对临床治疗、流行病学调查和食物中毒处置发挥积极作用。

副溶血性弧菌所致食物中毒实时荧光定量PCR筛查方法的建立及应用

目的建立副溶血性弧菌(VP)的实时荧光定量PCR测定方法。方法利用副溶血性弧菌toxR基因DNA序列设计引物和探针,用细菌标准菌株检测方法的特异性,VP纯培养液及模拟污染食物测定方法的灵敏度和重复性,并应用在2012年-2014年疑似细菌食物中毒调查中。结果当标准曲线在2.5×101copy^2.5×106copy时,线性关系良好,相关系数为0.998 6,线性方程为y=-3.413 2x+38.919 5;仅VP标准菌出现典型的"S"形荧光扩增曲线;质粒检测灵敏度为25 copy/ml,直接能检测到的最低菌液浓度:纯培养液为21 cfu/ml,模拟食品为1.8×102cfu/ml;同一模拟食品(1.8×104cfu/ml)测定的重复性好(批内Ct值变异系数为1.12%,批间变异系数为1.70%);食物中毒RT-PCR结果为阳性的26份肛拭中16份分离到VP,1份阳性食品分离出VP,未发现假阳性。结论本法快速、敏感、特异性好,在细菌性食物中毒检测的筛查中可大大提高检测效率。

多血清型副溶血性弧菌引起食物中毒的毒力基因检测和分子分型

目的对一起多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒病原菌进行毒力基因和分子分型研究。方法按照GB／T4789—2008食品卫生微生物学检验方法对事件中可疑样品进行病原菌分离鉴定，对检出的副溶血性弧菌（Vibriopara—haemolyticus，VP）做血清分型；采用实时荧光PCR检测分离菌株的毒力基因，并用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）进行分子分型。结果共检出12株VP（8株来自患者粪便、4株来自剩余食物）。12株VP经毒力基因检测，tdh阳性检出9株，其中一株来自剩余食物，其余均为患者粪便中分离；trh毒力基因均为阴性；经PFGE分型12株VP分为6个PFGE带型，聚类分析相似性百分比为66．8％～100％。结论该起食物中毒是由多血清型别VP引起的，其中03：K6型VP污染的凉拌海蜇是引起本次食物中毒的重要原因食品。PFGE分型技术适用于多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒事件的调查。