珍稀泌盐植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)愈伤组织诱导及增殖

以珍稀泌盐植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)成熟种子和不同发育阶段幼苗的不同部位为外植体,对其愈伤组织诱导和增殖进行了系统研究。结果表明:在添加3.0mg·L-12,4-D、1.0mg·L-1 NAA、0.5mg·L-1 6-BA、30g·L-1蔗糖和6.0g·L-1琼脂,pH为5.8的MSO培养基中,出愈率达70%以上,生长量高于其他培养基,是该植物愈伤组织诱导的最佳培养体系;7d下胚轴和25d的幼苗较适合愈伤组织诱导,可形成淡黄色疏松愈伤组织,且褐化程度相对较低;适宜的继代周期为30~40d,随着传代次数增加,愈伤组织颜色变淡,生长速度加快;NaCl浓度为50mmol·L-1和100mmol·L-1时促进愈伤组织生长,盐浓度过高则导致其生长受抑,甚至死亡。

长叶红沙(Reaumuria trigyna)植物区系地理分布研究

依据我国的植物标本和有关文献绘制了长叶红沙的分布区图，在此基础上确定了长叶红沙的植物区系地理成分为东阿拉善荒漠分布种，并讨论了本种的分布与邻近地区的联系，同时订正了本种花的颜色的描述．

长叶红砂钙依赖蛋白激酶RtCDPK16的非生物胁迫应答分析

植物受到逆境刺激后,钙离子结合蛋白能够感知钙信号并将其解码,激活下游靶蛋白,从而引发胁迫应答反应,钙调蛋白激酶在其中发挥了重要作用。长叶红砂为东阿拉善-西鄂尔多斯特有的珍稀泌盐植物,对干旱、盐碱等环境胁迫具有极强的适应性。本研究基于转录组数据,克隆了长叶红砂钙调蛋白激酶Rt CDPK16的开放阅读框(open reading frame,ORF),氨基酸序列比对和进化分析显示,其与拟南芥的同源性为78.46%,与葡萄Vv CDPK16同源性最高(80.97%)。基因表达特性分析显示,Rt CDPK16在根茎叶中均表达,且在根中表达量最高,同时其表达水平可被氯化钠(NaCl)/聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)/冷胁迫(cold stress,cold)/脱落酸(abscisic acid,ABA)等多种环境胁迫和氯化钙(calcium chloride,CaCl_(2))显著诱导。构建植物表达载体并转化拟南芥,对野生型拟南芥(WT)和过表达拟南芥(OE)株系进行干旱、盐和脱落酸胁迫,发现胁迫处理下OE株系的根长、鲜重和叶绿素含量等表型指标均显著高于WT,表明Rt CDPK16的超表达使转基因株系获得了更强的胁迫耐受性;生理生化指标检测显示,胁迫处理下各株系中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)等抗氧化酶活性及脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖(soluble sugar,SS)等渗透调节物质的含量均被显著诱导,且超表达株系显著高于WT,而过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))/超氧阴离子(superoxide anion,O_(2)^(-))的积累量显著低于WT;实时荧光定量(quantitativereal-time,q RT-PCR)检测发现,胁迫条件下OE株系的相关抗氧化酶基因、ABA合成和信号途径关键元件基因及脯氨酸合成基因均被显著诱导。以上结果表明,Rt CDPK16在拟南芥中的超表达通过调控转基因植物中抗氧化和渗透调节系统相关基因的表达和酶活性,促进转基因植物的渗透平衡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)稳态的维持,进而提高转基因植物的胁迫耐受性,这一过程可能是通过依赖于ABA信号的途径实现的。

濒危植物长叶红砂适应盐胁迫的生理生化机制研究

以濒危盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)幼苗为材料,研究了不同浓度NaCl溶液(0、100、200、300和400mmol/L)处理30d对其生长和生理生化指标的影响,以分析长叶红砂的耐盐生理机制。结果表明:(1)100和200mmol/L NaCl处理时,长叶红砂鲜重和干重均显著增加,但随着盐浓度继续增加,长叶红砂幼苗生长受到抑制,且地上部受到的抑制大于根部,显示长叶红砂适宜生长的NaCl浓度是200mmol/L。(2)随NaCl胁迫浓度的升高,长叶红砂的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)呈下降趋势,胞间CO2浓度(Ci)呈上升趋势,说明光合速率的下降使利用CO2的能力下降,胞间积累了大量的CO2,且盐处理浓度越高量越大。(3)随NaCl胁迫浓度的升高,长叶红砂幼苗Na+、Cl-含量增加,可溶性糖、脯氨酸、游离氨基酸及可溶性蛋白等有机渗透调节物质的合成增加。研究认为,长叶红砂是通过调节叶片Na+、Cl-以及有机渗透调节物质含量来提高其耐盐能力。

NaCl胁迫对盐生植物长叶红砂幼苗内源激素的影响

盐生植物长叶红砂为东阿拉善-西鄂尔多斯特有种,古地中海残遗珍稀植物,对盐渍荒漠具有极强的适应性.以培养条件下的长叶红砂为材料,研究不同浓度NaCl胁迫处理对长叶红砂幼苗内源激素的影响.结果表明:在盐浓度≤60mmol/L时,随着盐胁迫浓度的增加,ABA含量呈逐渐增加趋势,在80mmol/L取得最小值之后又逐渐增加;IAA、ZR、GA3表现为先升高后降低的趋势,均在60mmol/L处理时取得最大值.长叶红砂(IAA+ZR+GA3)/ABA比值和相对生长率随NaCl浓度增加均呈现先升高后降低的趋势,并均在80mmol/L时达到最大值.推测80mmol/L NaCl浓度是长叶红砂幼苗生长的最适浓度.因长叶红砂长期生长在盐生环境中,已经进化出对盐生环境的内部适应机制,盐胁迫下内源激素的综合调控对长叶红砂的生长发育起到至关重要的作用.

光照、温度和盐分对长叶红沙种子萌发的影响

无论在光下和暗中长叶红沙种子都能萌发，萌发率无显著差异；种子萌发的适宜温度为20-25℃。温度高于25℃时，温度越高，萌发率越低；浓度低于100mmol．L^-1的NaCl对种子萌发的影响不大，但高于150mmol．L^-1时，NaCl下的萌发率随着NaCl浓度的增高而下降，直至0；NaCl溶液处理9d的未萌发种子转移至蒸馏水中后，经高浓度NaCl胁迫（小于500mmol.L^-1）处理的种子萌发恢复率较高。

西鄂尔多斯珍稀濒危植物长叶红砂种子萌发特征

珍稀濒危灌木长叶红砂是我国西北干旱地区荒漠植被中的古老残遗物种,对维持荒漠植被稳定具有重要作用.本文研究了长叶红砂种子特性,及其在不同光照、温度、土壤水分和沙埋等环境因子中的萌发策略.结果表明:长叶红砂种子具有高活力、高萌发率、耐贮存的特点,在光照和黑暗条件下均能很好地萌发.种子萌发的适宜温度为恒温20℃～25℃或变温15℃/25℃,萌发率高达93.土壤含水量为2时,种子开始萌发;土壤含水量为12时,其萌发率最高,达89.长叶红砂种子适宜的沙埋深度为1cm,>5cm沙埋不出苗.沙埋深度对出苗率和幼苗生长高度的影响显著,而对幼苗质量的影响不显著.水分条件和沙埋深度是制约长叶红砂种子萌发和出苗的主要因素,而种子的高萌发率增加了幼苗生存的风险,不利于其应对荒漠极端环境变化.这种特性是长叶红砂濒危的重要原因之一.

盐生植物长叶红砂泌盐特性的研究

长叶红砂(Reaumuria trigynaMaxim.)为东阿拉善-西鄂尔多斯种,属我国特有,是古地中海残遗珍稀植物。通过对长叶红砂野外生存环境、泌盐结构以及泌盐特点的研究,结果显示:长叶红砂是一种具有多细胞盐腺的向外泌盐的泌盐盐生植物;长叶红砂植物体内、盐腺分泌物中盐分离子组分与生存土壤的离子组分一致,均含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、SO42-和Cl-等离子,但含量差异较大,其中土壤中阳离子以Na+或以Na+和Ca2+为主,阴离子以Cl-或SO42-为主;植物的根、茎、叶中阳离子却以K+为主,且6种离子含量的基本趋势均是:根<茎<叶;分泌物中Na+、Cl-的含量最高,其次是SO42-;盐腺的分泌速率表现为:上午的分泌量高于下午,白昼高于夜间,这些结果说明盐腺的分泌选择性与其保持植物体内适当的盐分和养分浓度以适应野生生境有关。

珍稀植物长叶红砂与近缘种红砂水分特征比较

运用PV技术对我国特有珍稀孑遗植物长叶红砂和生长于同一生境中的近缘种红砂的水分关系参数(Ψssat、Ψtslp、AWC、Va/Vo)进行了测定,并从水分生理生态角度对这两种耐盐强旱生小灌木抗逆性、适应性进行了比较研究.结果表明:1)与其它荒漠旱生植物相比,长叶红砂、红砂Ψssat值和Ψtslp值均很低,具有很强的保持最大膨压和维持低水势的能力,其耐旱机理主要表现为增加细胞质浓度的渗透调节,反映了这两种强旱生耐盐植物在水分参数上的特殊性.2)土壤盐分越高,植物组织Ψssat值和Ψtslp值越低,长叶红砂和红砂能够通过提高体内盐分含量而降低渗透势,提高渗透调节能力以适应不同的盐渍生境,在重盐土上生存的红砂体内具有较大的质外体水含量,抗脱水能力较强.3)同一生境下,红砂的Ψssat值和Ψtslp值均低于长叶红砂,AWC值和Va/Vo值均高于长叶红砂,红砂通过渗透调节控制蒸腾失水率的能力强于长叶红砂,其抗逆性强于长叶红砂.二者在长期自然选择下对环境的适应能力产生分化,红砂对可变环境的适应能力更强,长叶红砂生理生态方面的竞争力和内在适应力相对较弱.

濒危小灌木长叶红砂种群的遗传多样性

采用RAPD和ISSR2种分子标记对濒危小灌木长叶红砂5个种群的遗传多样性进行检测。18个RAPD引物和14个ISSR引物分别扩增出118和114个位点,多态位点比率(P)分别为88.98%和89.47%。在物种水平上,RAPD标记的结果为:Shannon’s信息多样性指数(I)为0.4656,Nei’s指数(H)为0.3303;ISSR检测的结果:I=0.4688,H=0.3083。2种分子标记均表明濒危小灌木长叶红砂具有较高的遗传多样性水平。Nei基因多样性指数表明,大部分遗传变异存在于种群内。RAPD分析发现86.22%的遗传变异发生在种群内;ISSR分析发现89.29%的遗传变异发生在种群内。种群间遗传变异低的主要原因是种群间存在较强的基因流(Nm)分别为3.0097和4.1787)。长叶红砂较高的遗传多样性水平与物种特性和对高胁迫环境的长期适应有关,濒危植物并不一定表现为遗传变异水平的降低。

长叶红沙劈裂生长的形态发生及其内源激素含量变化

研究荒漠旱生小灌木长叶红沙(Reaumuria trigyna)劈裂生长过程的形态发生及其内源激素含量的变化。结果表明:1)劈裂发生部位形成层活动不均匀,次生木质部的导管口径缩小,数量减少,木纤维含量增多,由此向内形成缢缩,之后缢缩部位前端的细胞不断解体,使得缢缩不断加深,相邻的两个缢缩部位通常要延伸到劈裂发生部位的中心位置连接在一起,整个维管束裂成多个单独的维管束,并相互分离。劈裂发生部位木质部中有异常的类似形成层的结构,木质部被几层扁平的细胞环分割成数轮,推测其与劈裂生长的发生密切相关。2)内源激素在长叶红沙不同部位含量不同,尤其在刚刚开始劈裂的过渡植株的劈裂发生部位IAA和ZR的积累量比根部大,可能共同调节这个部位细胞的生长和分裂,促进劈裂生长的发生。

珍稀泌盐植物长叶红砂两个WRKY转录因子的克隆及表达分析

根据长叶红砂转录组数据信息,选取在盐胁迫处理后表达上调明显且注释结果为WRKY转录因子的两个cDNA片段。通过cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）,从长叶红砂中克隆获得2个WRKY基因。在NCBI数据库比对与拟南芥AtWRKY33同源性分别为79%和87%,因此命名为RtWRKY33-1和RtWRKY33-2。其中RtWRKY33-1的cDNA全长2163bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为1681bp,编码573个氨基酸;RtWRKY33-2的cDNA全长2155bp,开放阅读框长度为1776bp,编码591个氨基酸。氨基酸序列分析表明这两个基因均具有两个WRKY结构域,属于典型的I类WRKY转录因子。蛋白结构预测分析发现,两个蛋白的一级结构和二级结构在WRKY结构域的氨基酸序列和结构特性的相似性较高,但是在非保守结构域部分,尤其是N末端（1-80aa之间）、第1个WRKY结构域之前（190-240aa之间）和两个WRKY结构域之间（430-450aa之间）等位置的差异明显,可能对两个基因功能有一定影响。半定量RT-PCR分析表明,4种非生物胁迫均能诱导这两个基因的表达,但是盐、冷和ABA对RtWRKY33-2诱导尤为明显,同时RtWRKY33-2对干旱胁迫的响应更快,因此这两个基因在长叶红砂抵御非生物胁迫的应答反应中发挥的作用可能不同。本研究为深入探索WRKY33转录因子在长叶红砂中的作用机制奠定了基础。

濒危灌木长叶红砂遗传多样性的RAPD分析

应用RAPD分子标记对濒危灌木长叶红砂(Reaumuria trigyna)种群遗传多样性进行了分析。应用18条随机引物对长叶红砂5个种群的95个个体进行扩增,检测到118个位点,其中多态位点105个。结果表明:长叶红砂种群的多态位点比率(P)为88.98%,显示出长叶红砂种群存在较高的遗传多样性。Shannon多样性指数(0.4966)、Nei基因多样性指数(0.3303)和基因分化系数(Gst=0.1425)的分析结果显示,长叶红砂种群遗传变异大多存在于种群内,种群间的遗传分化占14.25%。聚类分析表明,长叶红砂种群遗传距离与地理距离之间无直接相关关系。遗传多样性水平与物种特性和所处不同群落有关,濒危植物并不一定表现为遗传变异水平的降低。

泌盐植物长叶红砂质膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因(RtSOS1)全长cDNA的克隆及序列分析

长叶红砂为内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有珍稀泌盐,强旱生小灌木,对盐渍荒漠环境具有极强适应性。利用RT-PCR和RACE技术从该植物中分离出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(RtSOS1),该cDNA全长为3 829bp,开放阅读框为3 438 bp,编码一个含1 145个氨基酸的蛋白质,推测分子量为126.76 kDa。氨基酸序列的生物信息学分析推测,该蛋白N端含有11个跨膜结构域,C端为一个长约700个氨基酸的亲水性尾,具有磷酸化和自我抑制结构域。同源性比对和系统发育分析证实,RtSOS1与其他植物的质膜Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较近。

珍稀濒危植物长叶红砂种群遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对濒危小灌木长叶红砂(Reaumuria trigyna)集中分布的5个种群的遗传多样性水平和遗传结构进行了研究。14条引物共检测到114个位点,其中99个为多态位点,多态位点比率为86.84%,长叶红砂种群具有较高的遗传多样性。物种水平上Shannon多样性指数(I)为0.468 8,Nei基因多样性指数(H)为0.308 4;种群水平上,多态位点比率P为77.89%,I为0.410 6,H为0.260 9,基因分化系数Gst为0.106 9,揭示了长叶红砂种群遗传变异多存在于种群内,种群间的遗传分化较小,占10.69%。基因流(Nm)为4.178 7>1,说明种群间的基因交流,防止了由于遗传漂变导致的遗传分化。聚类分析表明长叶红砂种群遗传距离与地理距离之间无显著的相关性。研究结果说明遗传多样性水平与物种本身特性和所处不同群落有关,濒危植物并不一定表现为遗传变异水平的降低。

长叶红沙种子在萌发过程中细胞内营养物质动态研究

以长叶红沙种子为研究对象,经石蜡切片、染色、显微镜观察,来研究长叶红沙种子在萌发过程中营养物的动态变化,揭示长叶红沙这种旱生植物在其萌发过程中营养物消耗规律.发现长叶红沙种子中的贮藏物主要以蛋白质居多;并且萌发所需的能量依次由胚根、胚轴和子叶中的蛋白质的分解转化成多糖而来.该项研究从一个侧面提供了对这种旱生植物的生理学资料.

长叶红砂黄烷酮-3-羟基转移酶3基因(RtF3H3)的克隆、表达分析及酵母表达载体的构建

黄烷酮-3-羟基转移酶(F3H)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂F3H3(Rt F3H3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt F3H3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12,24,36 h)胁迫都能诱导Rt F3H3基因表达量升高。另外,构建了Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。

长叶红砂咖啡酸-O-甲基转移酶(RtCOMT)基因的克隆及蛋白纯化

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有双子叶盐生小灌木,有极强的耐盐抗旱性,入药可以治疗湿疹、皮炎等疾病,具有一定的药用价值。咖啡酸-O-甲基转移酶(RtCOMT)是一个重要的甲基化酶,主要调控木质素合成过程中中间产物及木质素的变化。基于高通量测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂COMT(RtCOMT)基因,构建RtCOMT原核表达载pET32a-RtCOMT,并将其转化大肠杆菌,重组阳性菌经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测。结果表明:RtCOMT基因开放阅读框长1 023bp,编码340个氨基酸,推测蛋白分子质量37.24ku,理论等电点(pI)6.71,发现该基因在大肠杆菌中正常表达得到与预期大小一致的融合蛋白。采用Ni-IDA His-Bind亲和层析方法对RtCOMT重组蛋白进行纯化,体外获得目的蛋白。

两种荒漠小灌木RAPD反应条件优化与引物筛选

分析了模板DNA、引物、Taq酶、dNTP、Mg2+浓度对红砂和长叶红砂RAPD扩增的影响,筛选并建立了适合红砂和长叶红砂的RAPD扩增反应体系:反应体积25μL,内含20 ng模板DNA,0.16μmol/L引物,0.5 U Taq DNA聚合酶,2.5 mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L dNTP,2μL10×buffer.用60个引物进行扩增,筛选出扩增效果好的18个引物,为进一步研究红砂和长叶红砂的遗传多样性奠定了基础.

红砂叶片和长叶红砂叶片中总黄酮含量测定

目的：提取红砂叶片和长叶红砂叶片中总黄酮并测定含量。方法：采用Na NO2-Al（NO3）3-Na OH法显色,芦丁为对照,紫外-可见分光光度法在510nm处测定。结果：红砂叶片和长叶红砂叶片中总黄酮的含量分别为19.72mg/g和17.69mg/g。回归方程为A=12.935c＋0.0003,相关系数r为0.9995,在0~60μg/m L范围内线性关系良好,回收率为95.83%~104.2%（n=9）,精密度、稳定性、重现性良好。结论：该法简便,准确,可作为红砂叶片和长叶红砂叶片中总黄酮的含量测定方法。