嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus RecJ核酸酶的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus (A.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将A.fulgidus RecJ (AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的带有末端荧光标记的寡核苷酸作为底物,体外反应后,利用8 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定AfuRecJ核酸酶的水解产物。【结果】AfuRecJ核酸酶具有单链DNA特异性的3’–5’外切核酸酶活性,酶活性依赖于二价金属离子Mn2+或Mg2+,且Mn2+存在条件下的催化效率明显优于Mg2+;其最适反应温度范围为55–65℃;高于200 mmol/L的NaCl会显著抑制AfuRecJ的核酸酶活性。AfuRecJ还具有单链RNA 3’–5’外切酶活性,且活性高于单链DNA底物。单链核酸3’末端的磷酸基团对水解活性有一定抑制作用。AfuRecJ对单链核酸的长度有一定的选择性,可以有效水解长度≥4个核苷酸长度的单链RNA、≥12个核苷酸长度的单链DNA,而且对双链DNA中的3’单链DNA结构(3’突出单链尾巴与末端分叉结构)具有类似单链DNA的水解活性。【结论】本研究证实AfuRecJ是一种单链核酸特异性的3’–5’外切核酸酶,且相比单链DNA,单链RNA为优势底物,推测其在胞内可能参与RNA降解与DNA修复。