表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应技术，用设计带有限制性酶切位点的引物，特异地扩增从起始密码子开始的１ ．８ ｋｂ 新城疫病毒（ Ｎ Ｄ Ｖ） 血凝素神经氨酸酶（ Ｈ Ｎ） 基因开放式阅读框，然后插入ｐ Ｔ Ｋ２ Ｂ 的 Ｎｈｅ Ⅰ位点，构建了含 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因的插入载体ｐ Ｔ Ｋ Ｈ Ｎ１ 和ｐ Ｔ Ｋ Ｈ Ｎ２ ，再与感染火鸡疱疹病毒（ Ｈ Ｖ Ｔ） 细胞的总 Ｄ Ｎ Ａ 共转染鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ） ，经有限稀释法和 Ｄｏｔｂｌｏｔ 筛选，得到含有 Ｈ Ｎ 基因的重组体ｒ Ｈ Ｖ Ｔ１ 和ｒ Ｈ Ｖ Ｔ２ 。经组织培养传代和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析，表明重组体在感染细胞中表达了 Ｈ Ｎ 蛋白。重组体在 Ｃ Ｅ Ｆ 上的生长特性与亲本病毒相同，且在连续传代过程中保持稳定。为国内新城疫基因工程疫苗研制奠定了基础。

表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因重组鸭肠炎病毒的构建

目的 构建表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因的重组鸭肠炎病毒（DEV）.方法 利用同源重组技术,在DEV Clone-03基因组中胸苷激酶（TK）基因内部插入新城疫病毒HN基因.以本实验室已构建的rDEV TK-EGFP株为亲本病毒,将病毒基因组与转移载体共转染及蚀斑纯化,获得表达新城疫病毒HN基因的重组鸭肠炎病毒.结果 重组病毒经基因水平和蛋白水平的鉴定,证明新城疫病毒HN基因正确插入DEV基因组内部且有效表达;复制动力学和遗传稳定性检测,证明重组病毒rDEV TK-HN滴度略有下降,但复制趋势与亲本病毒一致;在鸡胚成纤维细胞（CEF）和SPF鸡胚连续传代20代,表明HN基因随病毒传代而稳定遗传、表达.结论 利用同源重组技术,对鸭肠炎病毒基因组进行修饰,构建了TK基因缺失表达新城疫病毒HN基因的重组鸭肠炎病毒,该病毒能够携带HN基因稳定遗传和表达.

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应 (PCR)技术 ,用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增了从起始密码子开始的 1 8kb新城疫病毒 (NDV)血凝素 神经氨酸 (HN)基因开放式阅读框 (ORF) ,然后插入 pTK2 B的NheI位点 ,构建了含NDVHN基因的插入载体 pTKHN1和 pTKHN2 ,将其与感染火鸡疱疹病毒 (HVT)细胞的总DNA共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,经有限稀释法和Dot blot筛选 ,得到含有HN基因的重组体rHVT1和rHVT2 。对重组体进行组织培养传代和Westernblot分析 ,表明重组体在感染细胞中表达了HN蛋白 ,重组体在CEF上的生长特性与亲本病毒相同 ,且在连续传代过程中保持稳定。

重组腺病毒Ad－HP对肝癌细胞及肝癌肺转移模型的抑制效应

为探讨重组腺病毒Ad-HP对人肝癌细胞BEL-7402的影响及其对鼠肝癌肺转移模型的抑制作用,本研究利用MTT染色法进行了Ad-HP的体外抑瘤研究,并应用Annexin V检测、Caspase活性检测、AO/EB染色和DAPI染色等方法分析了Ad-HP的抑瘤方式。另外,本研究利用鼠肝癌细胞H22,建立了肝癌肺转移动物模型,并检测了Ad-HP对肝癌肺转移的抑制作用及其对模型动物免疫的影响。结果表明,Ad-HP能够有效抑制BEL-7402细胞的生长,且其作用具有一定时效和剂效关系趋势;Ad-HP感染导致BEL-7402细胞呈现磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加和Caspase酶活性增强等典型凋亡特征;应用Ad-HP治疗肿瘤模型能够有效延长模型动物平均生存期,控制转移灶形成,增强NK和CTL活性,上调Th1类细胞因子水平。总之,Ad-HT能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞增殖,并且能够有效控制肝癌肺转移灶形成,延长模型动物平均生存期。