重组蛹虫草超氧化物歧化酶对氧化压力下E.coli细胞的保护作用

为考察外源蛹虫草超氧化物歧化酶（cm-SOD）基因或蛋白对强氧化剂环境中E．coli的保护作用，分别在含强氧化剂和不含强氧化剂的培养基中培养重组蛹虫草超氧化物歧化酶菌株和对照菌株并诱导表达，测定菌体的生长速率及菌体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和活性氧（ROS）的变化。结果表明重组菌株对百草枯引起的生长抑制作用具有抗性，当百草枯的浓度在（0．02～1．5）mmol／L范围内，重组菌株的生长速率明显高于对照菌株；重组菌株的SOD酶活力明显高于同一环境中的对照菌株，CAT酶活力略高于对照菌株，而细胞内ROS含量明显低于对照菌株。说明外源cm—SOD基因在E．coli中的高效表达提高了菌体抵抗自由基引起的损伤的能力。

重组E.coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组E.coli产生的胆固醇氧化酶采用70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Phenyl Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤,得到的胆固醇氧化酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,酶的纯化倍数为93,收率为21%。部分酶学性质表明:酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH7.5,热稳定范围在40℃以下,酶的pH稳定范围为6～9,分子量分别为50 kD和52 kD。酶动力学参数Km值及Vmax分别为8.2×10-5mol/L和0.21 mmol/(L.min)。

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE SephadexA 5 0离子交换层析、HiPrep 1 6 1 0Phenyl疏水作用层析、Su perdex2 0 0HR 1 0 3 0凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶 ,比酶活达到 1 5 6 2 9U mg。此酶的最适温度为 70℃ ,最适pH7 0 ,在 6 0℃保温 6 0min酶活力基本不变 ,在pH3～ 8的范围内比较稳定。此酶的Km 和Vmax分别为 7 75mmol L和 2 7 8mmol·min- 1·mg- 1。 1mmol L的Zn2 + 、Ba2 + 、Mn2 +可使该酶完全失活 ,KCN、NaN3 、Na2 S2 O4 、巯基乙醇对酶活力有抑制作用 ,5 0mmol

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5～6.0较稳定;最适温度为50℃,40～50℃较稳定;Cu2＋和Fe2＋对其活力有显著的抑制作用,Mg2＋、Zn2＋和Mn2＋对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。

大肠杆菌表达的人重组IL-3的纯化

本文继大肠杆菌表达含凝血酶切点的人重组IL-3融合蛋白成功的基础上进一步探讨了天然型rhIL-3的纯化。超声破碎细菌细胞得包涵体,经洗涤处理可使包涵体纯度达90％,用8mol/L尿素变性溶解包涵体沉淀后直接稀释复性,再超滤浓缩、凝血酶消化,释放天然型rhIL-3。经DEAE Sepharose Fast Flow和Sepharcyl-100 HR层析得到天然型IL-3,纯度达96％,回收率20％以上,具有刺激正常人骨髓细胞形成集落的活性。本实验为大批量重组IL-3的生产创造了条件。

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。

重组蛋白对工程菌的保护作用

为考察重组蛋白对强氧化剂环境中工程菌的保护作用,分别在含百草枯及维生素K3(VitK3)的强氧化剂和不含强氧化剂的培养基中培养重组蛹虫草超氧化物歧化酶菌株和对照菌株并诱导表达,测定菌体密度(A600)及菌体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的酶活变化。结果表明:重组菌株对百草枯和VitK3引起的生长抑制作用具有抗性,百草枯和VitK3对重组蛋白的表达没有影响,重组菌株的A600、SOD酶活力明显高于对照菌株,CAT酶活力略高于对照菌株。说明外源基因在E.coli中的高效表达提高了菌体抵抗自由基引起的损伤的能力。

FimH重组蛋白的原核表达及纯化

目的:在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白。方法:采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重组蛋白的产量和增大其可溶性,最后以亲和层析分离纯化3种FimH重组蛋白。结果:成功构建出表达大肠杆菌(K12,BL21)和沙门氏菌(S.T.)FimH的原核表达载体pET28a-K12/BL21/S.T.,经酶切、测序和Western Blot鉴定,目的蛋白表达正确。在适当浓度的IPTG诱导,15℃震荡培养20h,可使FimH的表达量达到最大,分离纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为一条带。结论:本研究构建以3种FimH为表面呈现系统的表达载体,3种FimH基因和预测蛋白结构略有差异。本研究为后续研究3种蛋白生物活性差异及其靶向M细胞的免疫佐剂活性提供物质基础。

芽孢杆菌BSC6-1中纤维素酶基因的异源表达及酶学性质

从土壤中筛选获得1株高产纤维素酶的芽孢杆菌BSC6-1,为了进一步研究其纤维素酶的性质,克隆表达来自BSC6-1的新的纤维素酶基因Celbsc6,并通过纯化后用于酶学性质的研究。结果表明：成功在大肠杆菌中异源表达,该基因的表达产物为50kDa的蛋白。在70℃条件下酶活力保持80%以上,当pH 7-8时内酶活力保持在94%以上。证明,重组纤维素酶Celbsc6具有良好的热稳定性和pH稳定性。最佳的酶促反应条件为55℃和pH 7.5,镁离子浓度10mmol/L。在该条件下Celbsc6的米氏常数,Km值为7.89×10-3 g/mL,最大反应速率Vmax为0.11μmol/（L·s）。

2种不同方法纯化乳酸杆菌重组S-层融合蛋白的比较试验

将重组菌E.coli BL21(含重组质粒pGEX-SLP)经IPTG诱导获得重组融合蛋白GST-SLP,分别用非特异性的氯化锂沉淀方法和特异性的Pierce GST Spin Purification Kit纯化方法,将该融合蛋白进行纯化,纯化结果采用SDS-PAGE方法进行鉴定。结果显示,2种方法均能够获得大小约为71 ku的目的融合蛋白,但氯化锂沉淀方法纯化效果不及Pierce GST Spin Purification Kit方法。该研究结果为进一步研究乳酸杆菌S-层蛋白生物学特性提供了参考。

CFA／Ⅰ重组克隆定居因子菌毛抗原的纯化及形态学观察

用基因重组技术获得的高效表达肠毒素大肠杆菌定居日子抗原Ⅰ（ＣＦＡ／Ⅰ）的重组克隆，通过匀浆破碎、硫酸铵分级盐析部分纯化，再经超速离心及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０柱层析，得到了ＣＰＡ／Ⅰ的纯化样品，得率约为０．９ｍｇ／ｇ湿菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）显示一条蛋白质带，其分子量为１５ｋＤａ，与天然ＣＦＡ／Ⅰ相同。免疫扩散和蛋白质印迹试验证明，纯化的重组克隆ＣＦＡ／Ⅰ与天然ＣＦＡ／Ⅰ具有相同的抗原性及免疫原性。并在电镜下观察了ＣＦＡ／Ⅰ的菌毛形态。

大肠杆菌耐热性肠毒素(STa)的纯化及其特性鉴定

产肠毒素性大肠杆菌工程菌株pSLM004在限定性培养基上培养后,上清液经硫酸铵沉淀、丙酮抽提、Sephadex G-25凝胶过滤、DEAE-Sephadex A-25离子交换层析、Bio-gel P-4凝胶及反相高压液相层析,获得的STa纯化倍数为302.7倍,有效剂量达10.72ng/鼠单位,回收率为9.9%。纯化的STa在Sephadex G-25凝胶过滤时出现1个蛋白峰,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)呈现1条蛋白带;在100℃30min不失活,121℃15min则失活;在pH 1～10范围内保持活性;胰蛋白酶、链霉蛋白酶对其活性无影响;2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)可使其迅速失活,表明在STa分子中有生物活性所必需的二硫键存在。