Optimization for Purification and Characterization of Recombinant Hirudin Ⅲ from E. coli

Aim To optimize purification conditions of recombinant hirudin 3 in thefermentation broth and characterize the product. Methods Reambinant hirudin 3 was isolated andpurified from the fermentation broth by three column chromatography steps with macroporous resin,DEAE cellulose DES2 and preparative RP-HPLC, respectively, and the optimal conditions were obtained.Purity of the product was determined by SDS-PAGE and analytical RP-HPLC. The molecular weight wasdetermined by mass spec-trometry. The structure of the product was analyzed by peptide map.ResultsThe product with purity of 95.4786% was obtained after three purification steps in the optimumconditions with a total yield of 39%. The molecular weight of the product was 6 913.32 ± 6.55 Da,coincident to the theoretical molecular weight of r-hirudin 3. The structure of the product wascoincident to r-hirudin 3 either. Conclusion The optimized purification steps can be successfullyemployed for purification of r-hirudin 3 from E. coli using batch-type approaches. The productobtained with high purity was confirmed to be r-hirudin 3.

微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在皮肤屏障功能修复中的应用效果

目的探究微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白治疗因皮肤炎性衰老导致的皮肤屏障功能下降的有效性及安全性。方法选取2020年6月至2021年5月在本院接受面部皮肤治疗的30例患者作为研究对象,采用随机数字表法将其分为对照组(重组Ⅲ型人源化胶原蛋白)与治疗组(微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白),各15例。治疗后定期对患者进行随访,分别进行主观疗效评价及客观疗效评价。结果治疗后4、8、12周,治疗组的满意度显著高于对照组(P<0.05)。治疗后,治疗组的皮肤皱纹、纹理、红区、毛孔、弹性、皮肤经皮失水及皮肤含水量改善明显(P<0.05);对照组治疗后油脂改善明显(P<0.05)。治疗后12周,治疗组的总症状评分显著低于对照组(P<0.05)。结论微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对皮肤修复有较好的疗效,可增强皮肤屏障功能,为改善皮肤屏障功能、治疗因皮肤屏障受损引起的炎性衰老提供了新选择。

重组水蛭素Ⅲ的工程菌的培养及高密度发酵

为提高重组水蛭素Ⅲ工程菌的产水蛭素量 ,采用正交实验法确定了较佳培养基组分 ,优化了摇瓶发酵工艺和发酵条件 ,工程菌摇瓶水蛭素产量稳定在 2 0 0 0ATU/ml左右 ,30L发酵罐批式发酵水蛭素产量达到4 0 0 0ATU/ml,补料 -批式发酵水蛭素产量达到 80 0 0ATU/ml。

重组水蛭素Ⅲ的抗凝与抗血栓作用研究

目的 研究了自行研制的重组水蛭素Ⅲ在大肠杆菌中的分泌表达产物的抗凝与抗血栓作用。方法 采用大鼠下腔静脉血栓模型和大鼠体外A V循环模型进行水蛭素Ⅲ (HV3)的抗凝及抗血栓作用研究。结果 给予重组水蛭素 2 5 ,5 0 μg/kg两剂量的大鼠下腔静脉血栓重量分别为 2 1.30± 7.35mg和 10 .4 0± 16 .2 0mg ,生理盐水对照组为 5 9.5 0± 4 .95mg ;重组水蛭素 5 0、2 5 μg/kg的血栓湿重为 15 .3± 3.6mg和 2 1.5± 5 .3mg ,生理盐水对照组为 4 8.6± 4 .9mg。结论 重组水蛭素Ⅲ可显著减少静脉血栓重量 ,能显著地降低体外循环的血栓湿重 ,与生理盐水组比较具有很显著的差异 ,结合体外抗凝实验等结果表明 ,重组水蛭素Ⅲ具有很强的体外和体内抗凝抗栓作用 。

重组水蛭素Ⅲ口服制剂给药系统的初步研究

目的探讨重组水蛭素Ⅲ(以下简称rHV3)的口服制剂。方法采用在体原位肠袢法研究小肠和结肠在吸收促进剂作用下对rHV3的吸收情况,寻找促进rHV3肠道吸收的吸收促进剂和吸收位置;合成蛋白酶抑制剂——壳聚糖-EDTA轭合物(chitosan-EDTAconjugates,CEC),考察rHV3在胃蛋白酶和胰蛋白酶中的稳定性;将rHV3和促吸收剂、CEC乳化,考察其抗凝血作用。结果吸收促进剂能提高rHV3在肠道内的吸收水平,其中在0.5%EDTA-Na2的作用下rHV3经由小肠给药产生的抗凝血作用最强;CEC在消化酶的存在下对rHV3有保护作用;乳化微粒与单用rHV3的抗凝血作用有显著性差异。结论重组水蛭素Ⅲ和促吸收剂以及CEC形成的乳化微粒经灌胃能够发挥其抗凝血作用。

重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定性考察

研究基因工程菌E .coliAS1.35 7在LB培养基中传代 5 0代过程中菌种的稳定性。以菌体和菌落的形态、质粒稳定性 (ST)、质粒酶切图谱和水蛭素的表达量以及比活等方面进行考察 ,以评价工程菌的稳定性。重组水蛭素Ⅲ工程菌在传代 5 0代的过程中质粒稳定性高 ,传代 10代内质粒稳定性 (ST)为 98% ,且表达稳定 ,表达产物可达发酵液可溶性蛋白总量的 6 0 % ,产物的抗凝血酶活力大于 2 .0× 10 3 ATU/ml,传代 5 0代的菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态。重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定。

新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素Ⅲ基因研究

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体，将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入 ｐＫＡ质粒的 ＡＳＰｓⅡ编码基因 ａｎｓＢ中，使 ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的 ８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与 ＨＶ３形成融合蛋白，从而构建成 ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白表达质粒 ｐＫＡＨ，通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成 ｐＵＣ高拷贝数复制原点，进而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白高效表达载体 ｐＵＫＡＨ。该质粒在大肠杆菌 ＪＭ１０５宿主细胞中表达后，融合蛋白（１５． ６ ｋＤ）占细菌总蛋白 １０ ５％，该融合蛋白经 ＣＮＢｒ切割释放出活性水蛭素分子，抗凝血活力达约 ２０ ＡＴＵ／ｍｌ培养液，为以后进一步研究打下了基础。

重组人血管内皮抑素联合NP方案治疗晚期NSCLC随机、双盲、对照、多中心Ⅲ期临床研究

背景与目的EndostarTM(YH-16)是中国烟台麦得津生物工程股份有限公司开发的新型重组人血管内皮抑素(rh-endostatin),临床前研究结果显示该药能抑制血管内皮细胞增殖、血管生成和肿瘤生长.Ⅰ、Ⅱ期临床结果证明该药单药临床应用安全有效.本研究的目的是评价YH-16联合长春瑞滨和顺铂(NP)治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效和安全性.方法2003年4月～2004年6月,493例一般状况评分为0～2,经病理和细胞学确诊的Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者进入NP联合YH-16与NP联合安慰剂的随机、双盲、对照、多中心临床研究.研究的终点目标是有效率(RR)、临床受益率(CBR)、肿瘤进展时间(TTP)、生活质量(QOL)以及安全性.结果486例可评价疗效的患者中,试验组和对照组的总RR分别为35.4%和19.5%(P=0.0003),总CBR分别为73.3%和64.0%(P=0.035),总的中位TTP分别为6.3个月和3.6个月(P=0.0000).对初治患者,试验组和对照组的RR分别为40.0%和23.9%(P=0.003),CBR分别为76.5%和65.0%(P=0.023),中位TTP分别为6.6个月和3.7个月(P=0.0000);对复治患者,试验组和对照组的RR分别为23.9%和8.5%(P=0.034),CBR分别为65.2%和61.7%(P=0.68),中位TTP分别为5.7个月和3.2个月(P=0.0002).试验组的临床症状缓解率较对照组略高,但无统计学差异(P＞0.05).试验组与对照组疗后QOL评分比较有明显提高(P=0.0155).试验组与对照组在血液学及非血液学毒性方面,中、重度不良反应的发生率均无统计学差异.结论YH-16与NP方案联合,能明显提高晚期NSCLC的RR及中位TTP,且安全性较好,具有较好的临床应用前景.

注射用重组改构人肿瘤坏死因子联合化疗药物治疗非小细胞肺癌的多中心Ⅲ期临床试验

目的 观察并比较国产注射用重组改构人肿瘤坏死因子 (rmhTNF)加化疗药物和单纯化疗治疗人非小细胞肺癌的临床疗效和不良反应。方法 采用多中心、随机对照试验将 2 0 0例人非小细胞肺癌患者随机分为试验组和对照组 ,试验组 15 0例 ,对照组 5 0例。对照组仅给予化疗 ,而试验组在化疗的同时 ,分别在第 1～ 7天 ,第 11～ 17天肌肉注射rmhTNF 4× 10 6U /m2 ,两组均以 2 1天为一周期 ,连用两个周期。试验结束后比较试验组和对照组的有效率和不良反应。结果 试验组有 5例 ,对照组有 3例患者因为依从性原因出组 ,其余患者可供临床疗效和不良反应分析。试验组有效率为 46.90 % ( 68/ 14 5 ) ,对照组为 17.0 2 % ( 8/ 47)(P =0 .0 0 1)。试验组治疗后KPS评分为 86.0 2± 9.74,对照组为 80 .14± 9.10 (P =0 .0 2 5 )。试验组和对照组Ⅲ +Ⅳ度不良反应发生率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。与rmhTNF有关的不良反应主要有轻度发热、感冒样症状、注射局部疼痛、注射局部红肿硬结 ,均不需作特殊处理 ,治疗结束后均能自行消失。试验组和对照组均未见有严重肝肾功能、心电图异常 ,以及低血压等不良反应发生。结论 rmhTNF联合化疗药物治疗人非小细胞肺癌的疗效显著优于单纯化疗 ,rmhTNF能明显提高化疗药物的敏感性 ,改?

重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究

采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变 ,这种方法快速、简便 ,有效。通过突变 ,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第 33～36位的氨基酸残基替换为RGDS序列 ,并进行了高效分泌表达 ,表达产物分泌到细胞外发酵液中。改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比 ,两者的抗凝血酶活性基本一致 ,但体外抗血小板凝集试验结果表明 ,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性 ,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。

注射用重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性肿瘤Ⅲ期临床观察

目的 :评价注射用重组改构人肿瘤坏死因子 (rmhTNF)与化疗联合治疗恶性肿瘤的有效性及不良反应。方法 :共入选 5 2例患者 ,随机分为试验组 39例 ,对照组 13例 ,试验组用rmhTNh 4 0 0万u·m-2 ,im ,d1～ 7,d11～ 17,同时联合应用化疗药物 ,2 1d为 1个周期 ,连用 2个周期 ;对照组联合化疗方案同实验组 ,但不加用rmhTNh。结果 :4 5例患者可评价疗效。试验组 33例中有效率为 36 36 % (12 /33) ;对照组有效率为 8 33% (1/12 )。试验组有效率高于对照组 ,但两组之间无统计学差异 (P =0 0 70 )。不同病种疗效分析显示试验组肺癌的有效率 4 4 4 4 % (8/18)高于对照组 10 % (1/10 ) ,而试验组 3例头颈部肿瘤患者均有效。与rmhTNh有关的不良反应发生率为 72 73% (2 4 /33) ,主要为轻度注射部位疼痛 72 73% (2 4 /33) ,红肿硬结 4 5 4 5 % (15 /33) ,少数患者出现发热 ,感冒样症状。结论 :rmhTNh与化疗药物联合应用治疗恶性肿瘤 ,显示对肺癌、头颈部肿瘤有较好的疗效 ,且毒性反应较轻。

重组人肝再生增强因子可抑制肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达

在培养的肝星状细胞系中加入不同浓度的重组人肝再生增强因子 (hALR) ,于不同的时间点收集细胞 ,提取总RNA ,用逆转录定量PCR方法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达水平。结果表明 ,高 ( 0 2ng/L)、中( 0 0 2ng/L)、低 ( 0 0 0 2ng/L)浓度的hALR 3组肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达水平在 8、2 4、48、72h 4个时间点均明显低于对照组 ;大剂量组较中、低剂量组Ⅰ型胶原基因表达水平亦明显为低。中、低剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在 2 4、48、72h 3个时间点明显低于对照组 ;大剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在 8、2 4、48、72h 4个时间点均明显低于对照组 ,较中、小剂量组亦显著降低。提示重组人肝再生增强因子对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达有明显的抑制作用。

重组人血小板生成素治疗特发性和血液肿瘤化疗后血小板减少症的Ⅲ期临床研究

目的 :评估重组人血小板生成素 (rhTPO)治疗特发性和化疗后血小板减少的临床安全性和有效性 .方法 :①病例分组 :4例非霍奇金淋巴瘤 (NHL)患者入选随机交叉对照组 ,6例巩固治疗期急性白血病患者入选非随机自身对照组 ;难治性血小板减少性紫癜 (ITP)组入选 9例患者 ;②用药方法 :rhTPO 1 μg/kg ,皮下注射 ,每日 1次 ,疗程 1 4d ;③统计分析 :病例资料采用SPSS软件统计分析 .结果 :①血液肿瘤组 :试验组rhTPO治疗后血小板数均值、最高值皆大于对照 ,两周期血小板数用药前后差值相差显著 (P <0 .0 5 ) ,试验组血小板数低于 5 0× 1 0 9/L的持续日数、恢复至 75× 1 0 9/L和 1 0 0× 1 0 9/L以上需要日数均有不同程度缩短 ;②难治性ITP组 :rhTPO治疗后患者血小板数均值渐升高 ,至 1 7d达 1 0 1× 1 0 9/L ;用药前后血小板差值为 85 .6 7× 1 0 9/L ,其中血小板数达 30× 1 0 9/L ,5 0× 1 0 9/L及 1 0 0× 1 0 9/L所需日数分别为 9.89,1 3.5 6及 1 9.78d .结论 :rhTPO对部分难治性ITP及血液肿瘤化疗所致的血小板减少有一定疗效 。

抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果。用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度。成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合。该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础。

重组人表皮生长因子用于大鼠Ⅲ期压疮模型的实验研究

[目的]观察重组人表皮生长因子(rhEGF)用于治疗大鼠Ⅲ期压疮溃疡创面的疗效。[方法]采用SD大鼠制备Ⅲ期压疮动物模型,实验组16只用rhEGF喷洒创面,对照组16只用生理盐水溶液湿敷创面,治疗后的第3天、第7天、第10天、第14天取创伤组织制成组织切片,观察其病理学变化;动态观察rhEGF和生理盐水对溃疡愈合时间及愈合率的影响。[结果]两组溃疡创面愈合时间及动态愈合率比较差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]重组人表皮生长因子可以促进大鼠Ⅲ期压疮溃疡创面的愈合。

金因肽联合双料喉风散治疗Ⅲ度放射性皮炎的疗效观察及护理

目的探讨金因肽联合双料喉风散治疗Ⅲ度放射性皮炎的疗效及总结护理要点。方法将34例Ⅲ度放射性皮炎患者随机分为实验组与对照组,每组各17例。实验组患者采用金因肽联合双料喉风散治疗Ⅲ度放射性皮炎,对照组患者只采用金因肽治疗Ⅲ度放射性皮炎。观察两组患者的治疗效果。结果治疗后实验组患者治疗总有效率为100.0%,对照组患者治疗总有效率为64.7%,两组患者疗效比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论金因肽联合双料喉风散治疗Ⅲ度放射性皮炎疗效优于单独采用金因肽,值得临床推广应用。

重组人Ⅲ型胶原基组织工程角膜植入兔眼生物相容性研究

背景组织工程角膜由于更接近活体角膜形态，植入体内易于成活而成为当今眼科学关注的热点。目的探讨组织工程角膜重组人Ⅲ型胶原（RHC-Ⅲ）／聚[3-（甲基丙烯酰胺）丙基-二甲基（3-磺丙）胺]（PMPDSAH）互穿聚合物网络（IPN）（RHC-Ⅲ／PMPDSAHIPN）水凝胶植入兔眼的生物相容性及其作为角膜替代物的可行性。方法中国大耳白兔108只按照随机数字表法分为2个组，实验组90只，正常对照组3只，其他15只兔（30只眼）为同种异体移植组提供供体角膜。实验组根据角膜材料的不同分为RHC-Ⅲ／PMPDSAH IPN组、负载神经生长因子（NGF）的NGFRHC—Ⅲ／PMPDSAH IPN组和同种异体移植组，每组各30只兔，均取右眼为手术眼。将实验组3种材料移植入兔角膜前板层，术后裂隙灯下观察有无排斥反应，对角膜透明度、角膜新生血管（CNV）的变化进行评分，记录各组兔术眼角膜上皮化时间，观察期为6个月。分别于术后3d、1周、2周及术后1、3、6个月每组各取5只兔角膜行苏木精-伊红染色，术后6个月采用免疫组织化学法检测角膜上皮细胞特异性标志蛋白角蛋白K3的表达。对实验组3个亚组各时间点角膜透明度和CNV评分的差异比较进行多组独立样本的Kraskal—WallisH检验，3个亚组角膜上皮化时间比较采用单因素方差分析及LSD—t检验。结果实验的6个月中，RHC—Ⅲ／PMPDSAH IPN组、NGF RHC-Ⅲ／PMPDSAH IPN组和同种异体移植组兔术眼的植片均未脱出，未见免疫排斥反应。术后6个月，RHC—Ⅲ／PMPDSAH IPN组、NGFRHC-Ⅲ／PMPDSAH IPN组和同种异体移植组角膜透明度、CNV与正常对照组比较差异均无统计学意义（H=4．34，P=0．23；H=2．60，P=0．46）。NGFR HC-Ⅲ／PMPDSAH IPN组角膜上皮化时间最短，平均为（4．97±0．63）d，与RHC—Ⅲ／PMPDSAH IPN组和同种异体移植组比较差异均有统计学意义（t=11．97，P=0．00；t=5．80，P=0．00）；RHC-Ⅲ／PMPDSAH IPN组和同种异体移植组比较差异有统计学意义（t=6．32，P=0．00）。RHC—Ⅲ／PMPDSAH IPN组和NGF RHC-Ⅲ／PMPDSAH IPN组移植材料与兔角膜融合较好，术后2周材料部分降解，术后1个月材料均完全降解，术后6个月新生胶原纤维排列整齐，角膜上皮细胞中K3表达阳性。结论RHC—Ⅲ／PMPDSAH IPN与兔眼的生物相容性较好，NGF可以有效地促进角膜创口愈合和上皮再生，提高其力学强度后，有望作为一种安全有效的角膜替代物。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用，但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌，参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组，培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组，用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达，包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平，各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较，模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组，差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08，P〈0．叭），而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组，差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06，P〈0．01）。与正常组比较，模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低，差异有统计学意义（t=1．86E一05，P〈O．01），与模型组相比，水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高，差异有统计学意义（t=8．56E一05，P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤，rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。

高效表达dsRNA大肠杆菌BL21 RNase Ⅲ-的构建

为了寻找一种简洁、高效的dsRNA获得方式,降低RNAi技术的生产应用成本。应用PKD46介导的重组系统,将PKD46转入大肠杆菌BL21菌株体内,在L-阿拉伯糖的诱导下,产生重组蛋白,使宿主菌具有同源重组的能力,应用两端具有RNase Ⅲ基因40 bp同源序列的PCR产物对其染色体上的RNase Ⅲ基因进行了基因敲除,并在具有卡那霉素的LB平板上筛选到重组菌株。获得了一株能够利用IPTG诱导高效合成dsRNA的BL21 RNase Ⅲ-菌株,为进一步降低RNAi技术的生产应用成本奠定了基础。

用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建

目的利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力。结果所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基因Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×108。结论利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系。