hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究

目的通过体外实验探讨hVEGF165和hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体外生物学活性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。方法分别采用rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的rAAV-IRES-GFP(对照组)转染体外培养的第3代兔BMSCs,于转染后1、2、3、7及14d应用ELISA法及转染后14d应用Western blot法鉴定两组hVEGF165和hBMP-7表达;转染后14d行细胞免疫荧光染色观察hVEGF165和hBMP-7表达一致性。应用第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管状血管形成实验检测hVEGF165蛋白活性。取第3代BMSCs行诱导成骨实验,Gomori钙钴法ALP染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7蛋白活性。结果ELISA检测示随转染时间延长,两组hVEGF165和hBMP-7表达逐渐升高;实验组各时间点hVEGF165和hBMP-7表达量均明显高于对照组(P<0.05)。Western blot检测示实验组可见hVEGF165和hBMP-7表达,对照组未见阳性表达。细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF165和hBMP-7染色呈阳性,表达部位和强度具有较好一致性;对照组未见阳性表达。HUVEC管状血管形成实验示实验组HUVEC拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构;与对照组相比,管状血管数比较差异有统计学意义(P<0.05)。ALP染色见实验组细胞出现深染颗粒,对照组细胞内浅着色;与对照组相比,矿化结节数比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性。