血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

人工感染禽腺病毒血清1型对SPF鸡天然免疫反应的影响

试验旨在探究禽腺病毒血清1型(Fowl adenovirus serotype 1,FAdV-1)感染SPF鸡后产生的天然免疫反应及免疫调控机制。结果表明,感染FAdV-1后,观察组、感染组、对照组SPF鸡均无明显发病和死亡,剖检肌胃和腺胃可见轻微病变。感染初期小肠组织中Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)、5、7、21;禽β-防御素5(Avian β-defensins 5,AvBD5)、8;白细胞介素8(Inter leukin-8,IL-8)、18;MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)、C-Rel及p65基因表达量显著升高(P<0.05)。TLR2、TLR5、AvBD8、IL-8、MyD88、C-Rel和p65在感染后36 h(hour post-infection,hpi)表达趋势一致。感染后期,部分组织中TLR15、AvBD10、AvBD12、IL-8基因表达量显著上调(P<0.05)。试验说明SPF鸡感染FAdV-1初期的先天免疫应答是小肠中通过TLR2、5-MyD88途径产生并调控AvBDs及细胞因子清除病毒。试验为今后可通过外源条件提高禽类天然免疫机能,预防控制FAdV-1及相似病原提供重要理论依据。

表达绿色荧光蛋白的重组1型禽腺病毒的构建

目的构建表达绿色荧光蛋白的重组禽腺病毒。方法通过带有禽腺病毒基因组复制非必需区（nt40065～nt43684）侧翼序列和增强型绿色荧光蛋白基因的转移质粒与亲本禽腺病毒在鸡肝癌细胞内同源重组，缺失掉了两侧翼序列之间的复制非必需区而替换为增强型绿色荧光蛋白基因的完整表达盒。为提高同源重组率，对质粒转染细胞的条件进行了摸索，确定了最佳转染条件为细胞以3×10^5／ml密度接种到6孔板上，36h后用8μl lipofectamine 2000试剂和3她pUC—LR—eGFP质粒转染，蚀斑方法筛选重组病毒。结果获得了表达EGFP的重组病毒单一克隆株rFAV—I-eGFP。结论研究结果为开展禽类活载体疫苗研制及相关基础研究提供了有利参考。

禽腺病毒QU株一个复制非必需区的鉴定

禽腺病毒QU弱毒株属于鸭腺病毒1型病毒,可作为潜在的重组疫苗载体。为确定QU株的复制非必需区,参照鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区附近序列设计引物,扩增QU株基因组的一段3.4kb片段,插入来自pEGFP-C1质粒的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒片段,构建了含EGFP基因的重组质粒pADGFP。采用脂质体介导法,将重组质粒pADGFP与QU株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法筛选纯化表达绿色荧光蛋白的重组QU病毒株rQUGFP。该重组毒的生长曲线与亲本毒一致,连续传代后病毒滴度稳定。结果表明,QU株基因组右侧E4区附近一段包括ORF1、ORF8和ORF9三个开放阅读框的区域为病毒的复制非必需区,且插入的EGFP基因可以稳定表达。为进一步以禽腺病毒QU株为载体构建重组疫苗的研究打下基础。

血清1型禽腺病毒JS2017株感染性克隆构建及病毒拯救

取本实验室前期分离鉴定的1株非致病性血清1型禽腺病毒(FAdV-1)JS2017株,在LMH细胞扩大培养后提取病毒全基因组DNA,PCR分别扩增基因组左端1186 bp和右端1130 bp序列作为同源臂并克隆进质粒SuperCos-1内,成功构建了质粒pCos-UD。质粒pCos-UD线性化后与病毒全基因组DNA共转化入大肠杆菌BJ5183内,通过同源序列间发生同源重组,将完整病毒基因组DNA插入质粒载体中成功构建感染性克隆pCos-FAdV1。分别针对病毒基因组不同部位设计引物进行PCR检测,同时配合限制性内切酶酶切图谱分析确认感染性克隆中已插入完整的病毒基因组序列。通过AscⅠ酶切,从感染性克隆载体中释放完整FAdV-1基因组DNA片段,利用脂质体转染试剂转染入LMH细胞内,成功拯救出病毒cFAdV-1,病毒生长曲线的测定结果显示拯救病毒与亲本病毒JS2017株具有相似的复制能力。本研究中所构建的FAdV-1感染性克隆为进一步开发以FAdV-1为载体的禽用基因工程疫苗提供反向遗传操作技术平台。

禽腺病毒血清4型纤突蛋白1(Fiber 1)多克隆抗体的制备

为了制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白1(Fiber 1)的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,将FAdV-4感染的病死鸡组织中扩增得到的Fiber 1基因构建到原核表达质粒pCold I,获得pCold I-Fiber 1表达质粒;然后将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株中,加入1 mmol/L IPTG分别于16和37℃条件下诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示重组蛋白Fiber 1以包涵体的形式成功表达,分子质量约53 kDa。表达蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备得到兔源Fiber 1蛋白的多克隆抗体。Western blot检验结果表明制备的Fiber 1阳性血清1∶1000倍稀释时具有良好的反应性,间接免疫荧光试验测得多抗血清在1∶3000倍稀释时,仍具有较好的活性且特异性良好。本研究为后续FAdV-4检测方法的开发及其相关致病机制的研究奠定了物质基础。

血清4型禽腺病毒Fiber蛋白在杆状病毒中的表达及其在抗体检测中的应用

为建立检测血清4型禽腺病毒(FAdV-4)抗体快捷特异方法,本研究首先分别构建含FAdV-4纤突蛋白Fiber-1和Fiber-2的两个重组杆状病毒rBv-Fiber-1和rBv-Fiber-2。在利用IFA以及Western blot鉴定重组杆状病毒分别高效表达Fiber-1和Fiber-2蛋白的基础上,以Ni柱纯化蛋白,并作为特异性识别FAdV-4抗体的包被抗原构建间接ELISA方法。特异性试验表明,间接ELISA仅特异地检出FAdV-4阳性血清,而不与Ⅰ群其他血清型禽腺病毒及其他禽源病毒阳性血清反应。间接ELISA检测灵敏度高于常规IFA方法,批间和批内重复性变异系数均小于10%。临床血清检测结果表明,间接ELISA可有效检出感染FAdV-4或免疫FAdV-4灭活疫苗的鸡群中抗Fiber抗体,且检测结果与BioChek商品化ELISA试剂盒一致。结果表明,本研究利用杆状病毒系统表达的Fiber蛋白及基于表达产物所构建的间接ELISA方法在FAdV-4感染预警和免疫评估有良好的应用前景。

基于血清4型禽腺病毒fiber-1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了获得血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)fiber-1重组表达蛋白,并建立快速鉴别检测方法,本试验将FAdV-4 fiber-1基因连入pET-32a表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,将测序正确的重组蛋白经IPTG诱导表达、纯化和Western blot鉴定。以纯化的pET-32a-fiber-1重组蛋白作为ELISA包被抗原,优化反应条件,建立了检测FAdV-4抗体的fiber-1-ELISA方法。结果成功表达pET-32a-fiber-1蛋白,证实可与FAdV-4阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。特异性结果显示,除FAdV-4与FAdV-10外,与其他病原的抗体无交叉反应;阳性血清稀释1 600倍仍可检测到,批内和批间最大变异系数均小于10%。检测了176份临床样品,75份为阳性,101份为阴性。fiber-1-ELISA方法易于操作,特异性强,重复性好,为FAdV-4抗体监测提供了有效方法。