Chicken Embryo Inhibition Test of Recombinant Freeze-drying Chicken Interferon against Newcastle Disease Virus( NDV) F_(48)E_(10)

The paper was to study the inhibitory effect of recombinant freeze-drying chicken interferon against Newcastle disease virus （NDV） F48E10. Nine-day-old chicken embryos were inoculated with recombinant freeze-drying chicken interferon via allaotoic sack, while 10-day-old chicken embryos were inoculated with NDV F48E10, and in vivo protective efficacy of interferon on chichen embryos was studied. The results showed that the recombinant freeze-drying chicken interferon at the dose of 1.28 mg/embryo reached the protection ratio of 90% on chicken embryo infected by F48E10.

重组hIL-10质粒构建及其在毕赤酵母SMD1168中的表达和纯化

构建重组hIL-10真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达,为进一步研究hIL-10生物学功能及临床应用奠定基础。PCR扩增目的基因hIL-10cDNA,经EcoRI/XbaI双酶切后,将其亚克隆至同样双酶切的载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-hIL-10;电转化法,将其转入毕赤酵母SMD1168,甲醇诱导Mut+型转化子基因表达;对目的蛋白进行检测及纯化。扩增出了目的基因hIL-10cDNA,重组质粒pPICZaA-hIL-10经酶切鉴定和序列测定正确;表达产物经SDS-PAGE分析在42.0kD处可见较浓染条带,Westernblotting分析可见特异条带;ELISA检测72h上清液中目的蛋白浓度可达1.973mg/L;纯化后目的蛋白纯度达67.0%。实现了重组hIL-10在毕赤酵母SMD1168中的成功表达和初步纯化。

hIL-10修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的 :探讨hIL 10修饰DC对实验动物免疫功能的影响。方法 :将经hIL 10基因修饰或未修饰DC腹腔注射C5 7BL 6致敏小鼠 ,以致敏或未致敏C5 7BL 6单个核细胞作为反应细胞 ,以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞 ,共培养 6天 ,MTT检测细胞增殖 ,乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性。结果 :hIL 10对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用。hIL 10修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应显著低于未修饰DC细胞诱导小鼠淋巴细胞增殖反应 ,hIL 10修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性具有抵抗作用。结论 :hIL 10修饰的DC诱导同种小鼠淋巴细胞的增殖反应显著降低和对CTL胞毒活性抵抗。

重组hIL-10联合MTX对AA大鼠IL-1β、TNF-α含量变化和影像学变化研究

目的:以重组人白细胞介素-10(human interleukin-10,h IL-10)及其联合甲氨碟呤(MTX)作用佐剂性关节炎大鼠模型,检测血清IL-1β、TNF-α含量的变化情况,研究重组h IL-10联合MTX治疗佐剂性关节炎大鼠的效果。方法:AA大鼠造模后,用测量体重、足肿胀度、关节炎指数及组织病理学来评价造模是否成功,各药物处理AA大鼠模型后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清IL-1β、TNF-α的含量。用放射学检查来评估AA大鼠后足关节损伤的程度。结果:各治疗组IL-1β、TNF-α含量比模型组水平明显下降,各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),联合用药组对AA大鼠血清IL-1β、TNF-α有明显的抑制作用,影像学检查提示IL-1β、TNF-α水平与大鼠足骨关节的损伤程度成正相关,联合用药组治疗后骨侵蚀评分最低。结论:各治疗组对佐剂性关节炎大鼠血清中细胞因子IL-1β、TNF-α有抑制作用,这种抑制作用与骨关节影像学改变显著相关。联合用药组能有效降低AA大鼠的IL-1β、TNF-α水平,改善AA大鼠足关节损伤的治疗作用。

重组hIL-10对AA大鼠T淋巴细胞及IL-17A的影响研究

目的:以重组人白细胞介素-10(human interleukin-10,h IL-10)及其联合甲氨碟呤(MTX)作用佐剂性关节炎大鼠模型,检测T淋巴细胞亚群及IL-17A水平的变化情况,研究重组hIL-10及其联合MTX治疗佐剂性关节炎大鼠的效果。方法:用IL-10、MTX以及IL-10+MTX处理AA大鼠模型,用流式细胞仪测定各组大鼠血液中CD4^+T细胞与CD8^+T细胞比值,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清IL-17A的含量。结果:各治疗组CD4^+淋巴细胞总数与CD4^+/CD8^+值不同程度下降,各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。各治疗组IL-17A水平有不同程度下降,各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),联合组与IL-10组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:重组hIL-10能下调AA大鼠血液中CD4^+T细胞的数量及CD4^+/CD8^+比值,降低血清中IL-17A水平,联合组较IL-10组对血清中IL-17A影响更显著,提示重组hIL-10联合MTX在治疗类风湿关节炎中能更好地发挥作用。

重组hIL-10抗家兔皮肤移植排斥反应中血清IL-10及其抗体的检测

目的检测重组人白细胞介素-10(recombinant human interleukiu-10,rhIL-10)作用后皮肤移植家兔血清中IL-10及其抗体的变化,探讨外源性hIL-10诱生IL-10增强抑制效应和外源性hIL-10有无免疫原性,为rhIL-10的应用提供实验依据。方法家兔分为6组:①组rhIL-10低剂量,②组rhIL-10高剂量,③组环孢菌素(CsA)低剂量,④组CsA高剂量,⑤组rhIL-10+CsA低剂量联合,⑥组生理盐水组。移植术前1d开始用药,连续用药10d,肌肉注射。术前1d、术后1d、4d、7d、14d、21d、28d分别取外周血,分离血清,以ELISA方法检测血清中IL-10及IL-10抗体水平。结果①移植家兔血清IL-10检测,术后各组结果较术前均有升高,在术后7d达到高峰,术后4d、术后7d rhIL-10低剂量及高剂量组IL-10水平高于其余各组(P<0.05)。CsA低剂量及高剂量组IL-10水平低于rhIL-10组及联合组(P<0.05)。②移植家兔血清抗IL-10抗体检测,术后各组检测结果较术前均无明显升高(P>0.05),与抗体阳性对照比较有显著差异(P<0.05)。结论 rhIL-10抗家兔皮肤移植反应中,家兔血清IL-10含量在皮肤移植后明显升高,表明外源IL-10诱导内源性IL-10分泌,从而增强抑制排斥反应;外源IL-10注射后家兔血清中没有检测出特异性抗体,外源性rhIL-10进入机体没有免疫原性。

重组hIL-10抗家兔皮肤移植反应中CC、IL-8/CXCL8趋化因子的变化

目的:检测家兔皮肤移植经rhIL-10作用后,血清中CC、IL-8/CXCL8趋化因子的变化,探讨CC、IL-8/CXCL8趋化因子在rhIL-10抗免疫排斥机制中的作用。方法:皮肤移植家兔分6组:①rhIL-10低剂量,②rhIL-10高剂量,③CsA低剂量,④CsA高剂量,⑤rhIL-10+CsA低剂量联合和⑥生理盐水组;每只家兔均于术前1天开始肌注给药,连续注射10天;各组分别于术前1天、术后1、4、7、14、21、28天取外周血,分离血清,以ELISA法检测移植家兔血清CC、IL-8/CXCL8趋化因子水平。结果:(1)术后各组IL-8水平均升高,术后4天、7天⑥组IL-8水平高于各组(P<0.05)。(2)术后各组MCP-1水平明显升高,术后1天、4天,⑥组MCP-1水高于各组(P<0.05),术后7天⑥组MCP-1水平高于①组、⑤组(P<0.05);术后7天、14天CsA抑制组高于联合组(P<0.05)。(3)术后各组MIP-1α明显升高,术后4天⑥组MIP-1α水平高于①、③、⑤组,术后7天⑥组MIP-1α水平高于各组(P<0.05);(4)术后各组MIP-1β水平升高,但同时间段组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CC、IL-8/CXCL8趋化因子在皮肤移植后明显升高,表明在急性排斥反应中发挥了重要作用,随排斥反应加重而进一步增高,皮片排斥后下降,可作为观察和诊断移植排斥的合适标志物。

hIL-10在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

构建了含有人白细胞介素-hIL-10(Human Interleuk in 10,hIL-10)基因的重组质粒,在大肠杆菌中的高效表达,并对其生物学活性进行了鉴定.用RT-PCR扩增hIL-10 cDNA,并插入原核表达载体PET-32b.将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞,在37℃用IPTG诱导hIL-10表达.表达的重组蛋白经复性纯化后,用夹心ELISA法检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用.重组质粒PET-32b/hIL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列和文献报道的hIL-10 cDNA序列一致.SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18 000.活性测定结果显示,重组蛋白能显著抑制PBMC合成IFN-γ.这表明构建的PET-32b/hIL-10可以在大肠杆菌中高效表达,经复性和纯化后,获得了具有高纯度和活性的hIL-10.

病毒性脑膜炎患儿血清和脑脊液中IP-10和TNF-α的表达情况及临床意义

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、重组人干扰素诱导蛋白-10(IP-10)在病毒性脑膜炎患儿血清和脑脊液中的表达情况及临床意义。方法选取2019年7月至2020年12月在邢台市人民医院儿三科因急性中枢神经系统感染住院治疗的100例患儿作为研究对象。以脑膜炎感染类型分为病毒性脑膜炎组(52例)、化脓性脑膜炎组(34例)、结核性脑膜炎组(14例)。采用酶联免疫吸附试验检测所有研究对象血清及脑脊液TNF-α、IP-10水平。采用Pearson相关分析病毒性脑膜炎患儿血清及脑脊液TNF-α水平与IP-10水平的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估血清及脑脊液TNF-α和IP-10对病毒性脑膜炎的诊断价值。结果结核性脑膜炎组血清及脑脊液TNF-α和IP-10水平均高于化脓性脑膜炎组与病毒性脑膜炎组,且化脓性脑膜炎组均高于病毒性脑膜炎组,差异均有统计学意义(P<0.05)。病毒性脑膜炎患儿血清中IP-10水平与TNF-α水平呈明显正相关(r=0.313,P<0.05)。脑脊液中TNF-α水平与IP-10水平呈明显正相关(r=0.455,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清IP-10、TNF-α单独诊断病毒性脑膜炎的曲线下面积(AUC)分别为0.887、0.898,均小于2项指标联合诊断病毒性脑膜炎的0.958(Z=2.010、2.048,P<0.05);脑脊液IP-10、TNF-α单独诊断病毒性脑膜炎的AUC分别为0.926、0.908,均小于2项指标联合诊断病毒性脑膜炎的0.964(Z=2.208、2.260,P<0.05)。结论血清及脑脊液TNF-α和IP-10水平在病毒性脑膜炎患儿中明显降低,2项指标联合检测对病毒性脑膜炎的诊断具有重要临床价值。

乙肝疫苗无、弱应答与B7-CD28及IL-12、IL-10的相关性

目的 研究乙肝疫苗无、弱应答与B7 CD2 8分子及IL 1 2、IL 1 0的相关性。方法 分离并培养乙肝疫苗强应答和无、弱应答者PBMCs ,以PHA或rHBsAg刺激。用流式细胞术检测培养细胞CD80、CD86及CD2 8的表达 ;酶标法检测上清IL 1 2、IL 1 0的水平 ;MTT法检测细胞增殖反应。结果 rHBsAg刺激后 ,无、弱应答组与强应答组比较 ,CD80和CD86的表达率、IL 1 2和IL 1 0水平、细胞增殖反应均降低 ,差异显著 ;但CD4+、CD8+细胞CD2 8的表达率无显著差异。PHA刺激后 ,上述指标在2组之间均无显著差异。结论 乙肝疫苗无、弱应答者一般的细胞免疫功能正常。抗 HBs低下与CD80、CD86表达及IL 1 2、IL 1 0产生不足等有关 ,但无T细胞CD2

IL-10基因修饰的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨hIL-10基因修饰的未成熟树突状细胞(imDC)诱导大鼠肝移植免疫耐受的能力。方法:行以DA大鼠为供体、Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植100例,随机分为5组(每组4只):未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组及hIL-10基因转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC和hIL-10修饰的imDC各2×106个,于肝移植术后3、7、10d各处死4只,观察外周血肝功能及IL-12变化,并对移植后大鼠做生存分析。结果:IL-10组术后移植肝为非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应。肝功能示IL-10组在7d、10d时,肝功能有所恢复,但与imDC组及空载体组相比差异无统计学意义。ELISA检测示,术后7d,IL-10组的血清IL-12浓度均低于mDC组及imDC组。IL-10组中位生存期(40d)长于其他组。结论:hIL-10基因修饰的imDC诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受能力显著增强,显著延长同种异体肝移植大鼠的生存期。

高效表达重组猪IL-10的基因工程菌株的构建

白细胞介素 10(IL 10)是一种Th2细胞等产生的能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子。从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,用RT PCR扩增了猪IL 10(poIL 10)编码基因,克隆并测序验证后,将其亚克隆到表达载体pPROEXTMHTb中,转化DH5α后,用IPTG诱导培养,经免疫印迹和生物活性检测显示,重组菌株表达了具有活性的重组poIL 10,重组poIL 10表达水平达3mg/ml培养液,占菌体细胞总蛋白的30 2%,本研究为poIL 10的功能研究和临床应用奠定了基础。

重组人白介素-10对大鼠血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察重组人白介素 10 (rhIL 10 )分别对肿瘤坏死因子 (TNF α)和血小板源性生长因子 (PDGF BB)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响。方法 体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态 ,应用流式细胞术测定细胞周期。结果 与对照组相比 ,肿瘤坏死因子和血小板源性生长因子均对血管平滑肌细胞增殖具有明显的刺激作用 (P <0 0 5 )。rhIL 10单独应用对血管平滑肌细胞生长没有影响 (P >0 0 5 )。在TNF α和血小板源性生长因子分别刺激下 ,rhIL 10均可抑制血管平滑肌细胞的生长(P <0 0 5 )。流式细胞术测定的结果显示rhIL 10分别可以使TNF α和PDGF BB作用下的VSMCs大部分处于G0 /G1期 ,与对照组相比差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 重组人白介素

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。

重组人IL-10对皮肤移植家兔血清中IL-17家族水平的影响

目的检测皮肤移植家兔注射重组人IL-10(rhIL-10)后血清IL-17家族水平的变化,探讨IL-17家族在rhIL-10抗免疫排斥机制中的作用。方法皮肤移植家兔分6组,分别为rhIL-10低剂量组、rhIL-10高剂量组、环孢菌素A(CsA)低剂量组、CsA高剂量组、rhIL-10+CsA低剂量联合组及生理盐水组。于皮肤移植术前1 d开始用药,每只家兔连续10 d肌肉注射。各组分别于皮肤移植术前1 d、术后1、4、7、14、21、28 d取血,分离血清,以ELISA法检测血清中IL-17家族细胞因子水平。结果术后IL-17A～F水平较术前明显升高,在术后14 d达到峰值,然后逐渐降低。rhIL-10能抑制IL-17A、IL-27、IL-17F的分泌及促进IL-25的分泌,抑制强度与使用剂量成正相关。结论 IL-17家族细胞因子大量分泌,可能介导移植后的炎症反应,促进炎性因子分泌从而参与移植排斥反应。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL10。方法限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切目的基因IL10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL10pET32a,测序正确后转化E.coliBL21(DE3),不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDSPAGE和Westernblot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC9细胞增殖法分别测定IL10的含量及生物学活性。结果构建的表达重组载体IL10pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL10Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westernblot鉴定存在有目的蛋白IL10,MC9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL10Trx,有助于下游纯化和制备hIL10基因工程药物。

体外导入外源IL-10基因对HSC增殖的影响

目的利用重组复制缺陷型腺病毒AdIL 10将外源IL 10基因导入肝星状细胞 (HSC) ,并观察其对HSC增殖的影响。方法将本实验室自行构建的重组腺病毒质粒pAdIL 10用Lipofectamin包装转染HEK 2 93细胞 ,即可获得重组腺病毒AdIL 10。应用胶原酶原位灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC ,当HSC生长至 80 %密度时 ,以 5× 10 4细胞 /孔接种于 96孔板 ;HSC培养 2 4h后 ,取病毒AdIL 10以感染复数 (MOI) 5 0感染HSC ;用MTT法检测HSC增殖率。结果pAdIL 10经 2 93细胞包装 ,3d后可观察到绿色荧光蛋白 (GFP)表达 ;AdIL 10感染HSC 3d后可观察到GFP表达 ,且HSC增殖受到抑制。结论重组腺病毒AdIL