重组类人胶原蛋白的分离纯化

目的 建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺。方法 将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离纯化。结果 发酵菌体干重达到71g/L,表达量为菌体蛋白量的29.4％,最终产物纯度达98％,回收率为80.5％,纯化倍数为3.4。结论 纯化的类人胶原蛋白达电泳纯,相对分子质量为90 000,N端序列为NH_2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G,均与其因序列设计一致。

重组人骨形成蛋白-4的大规模制备

含有能够高表达重组人骨形成蛋白成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP- 4m)质粒的工程菌株,导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,测定发酵菌液OD600值为30．8。离心收集菌体, PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％。悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的83．2％。预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上SP-Sepharose FF阳离子柱,以0.35 mol NaCl洗脱,获得纯度为96％的hBMP-4m。其收获量为1．34g/L发酵液;收得率为36．4％。结果表明:使用这套工艺流程大规模制备hBMP-4m,能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。

重组人Ⅲ型胶原蛋白的表达纯化及性能研究

目的表达和纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白(rhCol),并评价其性能。方法构建重组基因工程菌pET30a(+)-1880/pACYCDuet-hy726/BL21(DE3),稳定共表达rhCol和脯氨酰羟化酶。通过大肠杆菌高密度发酵与盐析和柱层析蛋白纯化技术制备并纯化rhCol。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rhCol的纯度,全自动蛋白质多肽测序仪测定rhCol的N端氨基酸序列,紫外分光光度法测定rhCol中的羟脯氨酸含量,噻唑蓝法评价rhCol的细胞相容性。结果高密度发酵最终菌体湿重约200 g/L,表达量约3 g/L,通过亲和层析获得的rhCol的纯度大于95%。rhCol的羟脯氨酸含量为11.44%,其水溶性及细胞相容性良好。结论本研究制备的rhCol可作为一种优良的生物材料广泛用于皮肤护理及生物医药等领域。