胰岛素生产工艺及车间设计

在药品生产车间的设计过程中,对产品及其工艺的正确理解至关重要。特定工艺所需要的条件对设备的布置、乃至整个车间的布局都有很大的影响。文章简述了胰岛素产品的发展历史,对现行主流产品的生产工艺和车间设计做了一般性介绍,针对胰岛素原料药产品纯化工艺复杂、甲类试剂用量大的特点,采用实际项目案例进行解释,阐述了胰岛素生产车间的设计方法。

重组人促红细胞生成素的基本特性研究

重组EPO细胞灌注法培养的收获液,用Q SepharoseXL,C4反相疏水和Superdex75层析柱纯化表达的EPO.经SDS PAGE、PAGE和HPLC分析纯度达98%以上,总回收率为17%.经SDS PAGE分析其表观分子量为32～40kD.用IEF方法测得pI为3.75～4.15.网织红细胞计数法测得体内比活大于1.5×105IU,用ELISA测得体外活性为1.5×106～1.6×106IU.纯化的EPO的氨基酸组成和其它一些性质也进行了研究.

无血清培养基生产重组人红细胞生成素的纯化

用无血清培养基在生物反应器中培养CHO EPOC2细胞株 ,培养上清中重组人红细胞生成素表达水平达 1 0～ 2 1mg/L .培养上清经过三步纯化后纯度可达到 98%以上 ,比活性约为 1 5×1 0 5U/mg.纯化第一步使用反相柱层析 ,可将样品体积浓缩约 30倍 .取其收集液进行DEAE 离子交换柱层析 ,最后进行分子筛层析 ,全过程回收率为 4 0 %左右 .SDS PAGE表明 ,所制备终产品分子质量为 35～ 4 0ku ,等电聚焦方法测其等电点在 3 75～ 4 1 5之间 ,均属文献报道范围 ;ELISA和蛋白质印迹实验结果证明其具有天然红细胞生成素抗原性 ;采用溴化氰裂解方法做肽谱电泳 ,结果与理论推测相符 .该纯化路线简单、迅速、高效 ,重复性好 。

甲醇酵母分泌表达重组人干扰素α1b纯化工艺的建立

建立适合大规模、低成本生产重组人干扰素α1b(Recombinanthumaninterferon α1b ,rhIFN α1b)的纯化工艺。采用高效分泌表达rhIFN α1b的甲醇酵母工程菌发酵 ,收集离心后的上清液 ,超滤脱盐 ,经离子交换柱和分子筛柱层析纯化。纯化的rhIFN α1b的纯度为 98%以上 ,比活性 2 .4× 10 7IU/mg ,活性回收率 14 % ,相对分子质量 1980 0和等电点 5 .0。经检测 ,rhIFN α1b蛋白N 端 15个氨基酸序列与正常对照完全符合。该纯化工艺简便 ,时程短 ,重复性好 。

微电纯化装置用于重组人促红细胞生成素的质谱分析前样品快速除盐

利用实验室构建的微电纯化装置(Microelectro purification device,MEPD),采用电喷雾质谱正离子模式检测,在2 min之内实现重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的在线脱盐,同时和传统的C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm)梯度洗脱以及超滤管除盐结果进行比较。利用MEPD除盐后,rhEPO特征离子信噪比增加,检测灵敏度明显提高,操作时间大大缩短。本方法简单、快速,可作为质谱分析rhEPO样品的前处理方法。

重组人红细胞生成素大规模制备中反相色谱的条件优化

目的优化重组人红细胞生成素(rhEPO)大规模制备纯化中主要影响回收率的反相色谱的条件,提高回收率。方法采用反相纯化作为三步法纯化的第一步,利用R1型反相填料采用不同分步洗脱条件进行洗脱。结果优化后经第一步反相色谱所得rhEPO蛋白纯度达70%,再通过阴离子交换和凝胶过滤色谱纯化,rhEPO终产物的纯度可达100%,体内比活达1.91×105IU/mg,rhEPO蛋白的回收率提高了1.2倍。结论优化的反相纯化条件(30%乙醇-1.5 mol/L尿素,60%乙醇-3.0 mol/L尿素)能更有效的从培养上清中大量纯化出rhEPO,回收率高。获得的产品纯度高,体内外活性好。适合大规模纯化。

重组人促红细胞生成素纯化工艺的优化

采用堆积床生物反应器 ,用无血清培养基培养分泌重组人促红细胞生成素 ( rh EPO)的工程细胞株ZK970 3.所收集的上清 ,采用阴离子交换层析 -反相层析 -分子筛层析三步纯化工艺路线 ,分别用 Q-SepharoseXL-C4 -S-2 0 0 (方法 )和 DEAE Sepharose FF-Source-S-2 0 0 (方法 )纯化 3批产品 ,所得 EPO纯度达 98%以上 ,体外比活性大于 1 .3× 1 0 5 IU /mg.方法 、方法 纯化过程的 EPO体外活性回收率分别为 2 3.56%和2 8.57% .本纯化方法 工艺纯化日程短 ,分离效果好 ,EPO体内、体外活性回收率较高 ,更适合于大规模生产重组人促红细胞生成素 .

重组人促红细胞生成素中试纯化工艺研究

采用堆积床生物反应器，用无血清培养基培养分泌ｒｈＥＰＯ 的工程细胞株ＸＰ９５０１ 。所收集的上清液，经过快速离子交换层析—反相—分子筛层析纯化后，所得ＥＰＯ 纯度达９９ ％ 以上，比活性为１－５ ×１０５ＩＵ／ｍｇ 。整个纯化全过程的ＥＰＯ 体内活性回收率为４６ ％ 。所纯化的ＥＰＯ 分子量为３６ｋｄ ，等电点为３－５ 。免疫印迹证明其有天然ＥＰＯ 的免疫原性，Ｎ 端１５ 个氨基酸序列分析与文献报道一致。本纯化工艺路线简单，时程短，重复性好，适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。

采用DOE试验方法优化重组人干扰素α2a纯化工艺

目的采用DOE试验方法对重组人干扰素α2a纯化工艺参数进行优化,并寻找各参数的操作空间,为实际的产品生产提供指导。方法利用DOE中的中心符合表面设计(CCF)模型,设置两个响应值目标蛋白纯度和得率,对重组人干扰素α2a纯化工艺的疏水层析精纯进行优化并找出操作空间。选取两个工艺参数,即洗脱液B的(NH4)2SO4浓度(0.60M·L-1~0.70M·L-1)和洗脱液C的(NH4)2SO4浓度(0.30M·L-1~0.40M·L-1)。结果从模型的线性、正确性、有效性和重复性判断,所建立的模型拟合度高,可较为准确的预测实验结果。其中,洗脱液B的(NH4)2SO4浓度、洗脱液C的(NH4)2SO4浓度以及各自的平方对响应值有显著影响。同时,利用sweet spot找出关键层析步骤的操作空间。

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.5~6.5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。