注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对绝经后女性类风湿关节炎血清性激素水平的影响

目的:了解注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(以下简称益赛普)对绝经后女性类风湿关节炎(RA)患者血清性激素水平的影响,探讨性激素在绝经后女性RA中的临床意义。方法:选取绝经后女性RA患者65例作为RA组,健康体检者65例作为健康对照组。采用微粒子化学发光法测定2组血清睾酮(T)、雌二醇(E_2)水平,计算E_2/T比值,评估其与红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、DAS28评分、健康评估问卷(HAQ)等指标的相关性。RA组给予皮下注射益赛普,每次25 mg,每周2次,1个疗程12周。比较治疗前后E_2、T水平,E_2/T比值及临床指标的变化。结果:RA组血清E_2水平及E_2/T比值显著高于健康对照组(P<0.05);2组血清T水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前,RA患者E_2水平、E_2/T分别与ESR(r=0.688,P=0.000;r=0.722,P=0.000)、CRP(r=0.499,P=0.000;r=0.505,P=0.000)、DAS28(r=0.756,P=0.000;r=0.413,P=0.001)、HAQ(r=0.603,P=0.000;r=0.416,P=0.001)呈正相关性。RA组经益赛普治疗后,血清E_2水平、E_2/T比值显著低于治疗前(P<0.05)。结论:血清性激素水平变化及雌雄激素比值失调可能参与了绝经后女性RA的发病,可能作为评估RA活动的指标。益赛普治疗可促进绝经后女性RA患者性激素水平及雌雄激素比值的恢复。

CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化

目的优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化培养基:Gly-1:EX-CELL Glycosylation Adjust、Gly-2:SHEFF-CHO PLUS PG ACF、Gly-3:EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed),对rhGH-Fc糖基化修饰进行调整,并通过质谱分析目的蛋白的糖基化类型及比例。结果Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F(主要糖型一般为G0、G1和G2,F为岩藻糖)分别为32.89%、58.66%、33.28%,G1F分别为31.39%、18.03%、34.90%,G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%,Gly-1与Gly-3使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F;Gly-3补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少。结论Gly-1培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,Gly-2培养基使糖基化修饰从G2F、G1F向G0F转变,Gly-3培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,且高甘露糖含量在5%以下。Gly-3培养基可能具有更好的修改目的蛋白糖基化类型及比例的效果。

实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为:上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0~8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

rhGH-Fc工程细胞的构建及筛选

目的研制具有较长半衰期的长效重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH),构建并筛选出高表达rhGH-Fc免疫融合蛋白的细胞株。方法将hGH基因与特异位点突变后的人抗体IgG4Fc段用柔性linker连接,克隆至GS双表达载体上,构建重组表达质粒,经两次双酶切鉴定及测序分析后,将构建正确的质粒稳定转染CHO-k1细胞。通过逐渐提高蛋氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine,MSX)浓度,ELISA法筛选高表达的细胞株;利用亲和层析初步纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、HPLC、等电聚焦电泳分析;通过大鼠去垂体法测定长效rhGH的生物学活性,比较本课题研制的长效GH与其他普通GH的半衰期。结果重组质粒phGH-Fc-1经两次双酶切及测序鉴定,证明构建正确;成功筛选出高表达rhGH-Fc融合蛋白的细胞株,表达量可达1g/L;纯化的目的蛋白相对分子质量大小及等电点均与理论值一致,纯度可达95%以上;经大鼠去垂体体内活性测定,其比活为1.1IU/mg,依大鼠体重增长情况判断,其生物半衰期高于普通rhGH。结论成功构建并筛选出高表达长效rhGH的工程株,为后续长效rhGH的研制奠定了基础。

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.5~6.5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。

表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。

重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析

目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。

表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性分析

目的分析表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性,确定细胞的生产稳定代次。方法取表达rhGH-fc融合蛋白的CHO细胞(35代),连续传代建立50、70、90代细胞库。复苏各代次细胞并进行培养表达,绘制不同代次的细胞生长曲线,比较不同代次细胞在对数生长期的比生长速率;培养结束,对不同代次细胞表达的蛋白进行亲和层析纯化,比较其表达量,Western blot法对表达蛋白进行鉴定,通过对目的基因mRNA测序比较目的基因的稳定性。结果 50和70代细胞与35代相比,生长曲线基本重合,90代细胞曲线出现差异;50、70、90代细胞在对数生长期的比生长速率与35代相比,差异均无统计学意义(P>0.05),但90代的P值已明显降低;50和70代细胞重组蛋白表达量与35代相比,差异均无统计学意义(P> 0.05),但90代细胞重组蛋白的表达量下降比例达42%;各代次细胞rhGH-Fc基因序列保持稳定,与理论一致。结论表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的生产稳定代次为70代,可满足后续研究和生产需要。