重组人血清白蛋白表达研究进展

本文综述了重组人血清白蛋白在细菌 ,酵母 ,植物和动物等表达系统中表达的研究进展。用酵母表达系统 ,尤其是毕赤酵母 ,表达的重组白蛋白产量高且提取工艺简单 ,是其产业化最具有前途的表达系统。同时在转基因动物、植物中培养表达也具有诱人的前景。

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌 Pichia pastoris的发酵条件进行了实验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 ( OD60 0 )为2 0左右时 ,细胞生长的延迟期约为 2 .1 1 h,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y=0 .7841 e0 .2 319t(线性相关系数 r=0 .9936) ;在补料发酵时细胞浓度可达 1 1 5 g/L～ 1 60 g/L (干重 ) ,在 1 2 0 h重组人血清白蛋白表达量达 3.

重组人骨保护素片段OPG^(179)与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达

目的:在毕赤酵母中融合表达人骨保护素(OPG)片段OPG179与人血清白蛋白(HSA)。方法:通过RT-PCR扩增获得OPG179基因,构建表达质粒pHILD2-rhOPG179-HSA,转化至毕赤酵母菌中进行表达、纯化,对分泌表达产物进行SDS-PAGE及Western印迹检测。结果:酶切鉴定与测序结果显示重组表达质粒pHILD2-rhOPG179-HSA正确;经Western印迹检测,融合蛋白rhOPG179-HSA的相对分子质量约为97×103,符合预期值;rhHSA-OPG179在毕赤酵母中的表达量约为80 mg/L。结论:表达并纯化制备了重组骨保护素片段与人血清白蛋白的融合蛋白,为后续的生物学活性研究奠定了一定的基础。

人血清白蛋白及其重组表达研究进展

人血清白蛋白在医疗方面有广泛的应用,其可作为血容量扩张剂和辅助治疗剂、培养基组分和保护剂、药物制剂、诊断试剂和医疗器械包被剂等。基因重组技术提供了一种规模制备人血清白蛋白的有效途径,并已建立了多种人血清白蛋白的重组表达系统。本文综述了重组人血清白蛋白在细菌、真菌、转基因植物和转基因动物等表达系统中的发展和应用概况。

重组人组蛋白H3和H4的表达纯化及其细胞毒性分析

细胞外组蛋白在脓毒症、类风湿性关节炎、急性肺损伤等多种疾病的发生发展中起关键作用,但由于缺乏合适的标准品,至今无法对患者体内的胞外组蛋白进行精确定量,导致在多种感染性疾病中无法根据血清组蛋白含量对疾病进行精确分级,也无法据此合理用药。同时,对患者体内胞外组蛋白精确定量也有助于确定细胞毒性机制研究的使用剂量。本研究用大肠杆菌表达单体变性组蛋白H3和H4,亲和纯化后用梯度稀释和透析方法,可以得到复性的组蛋白单体H3、H4以及H3/H4复合物。通过对蛋白质在纯化过程中稳定性的比较,发现H3/H4复合物较单体更为稳定。以该复合物（50μg/m L）处理HUVEC细胞,细胞存活率约为20%,与小牛胸腺组蛋白（200μg/m L）的毒性类似。该复合物引起的细胞毒性可被人血清白蛋白以浓度依赖的形式（0.625~10 mg/m L）缓解,提示其构象基本正确。因此,重组组蛋白H3/H4复合物可以作为精确定量组蛋白的标准品,对基于组蛋白含量的疾病分级和组蛋白毒性机制的研究均有应用价值。

人血清白蛋白的生物制备工艺优化

通过中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO)表达系统制备人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA),为HSA及其融合蛋白质药物的制备及功能研究提供依据。首先构建含有目的基因的重组表达质粒pMH3-HSA,通过有限稀释法和Dot blot检测筛选阳性单克隆,随后扩大培养并悬浮驯化,然后运用5 L一次性生物反应器进行高密度放大培养,以无血清培养基B001和F001分别作为基础和流加培养基,以55 r/min、DO 20%~40%、pH 6.8~7.4、Tm 37℃为基础参数进行发酵控制,通过细胞计数、SDS-PAGE、Elisa、Western Blot等实验方法,检测发酵过程中的细胞生长状态以及目标蛋白HSA的表达情况,同时与毕赤酵母表达系统制备的HSA进行比较。结果表明:1)成功构建并筛选出了含外源HSA基因的高表达单克隆CHO细胞株;2)在5 L一次性生物反应器中进行流加培养,HSA的最高产量达180μg/mL;3)CHO表达系统产物几乎无降解。综合表明HSA蛋白更适合在CHO系统中进行表达,其蛋白完整性优势在该系统中表现得尤为明显。

重组人血清白蛋白在CHO细胞中的高效表达及其培养工艺优化

目的在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高效表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),并优化其培养工艺,为HSA的规模化生产奠定基础。方法利用基因重组技术构建HSA的真核表达载体,并将其电转染至全悬浮CHO细胞中,利用G418及有限稀释法筛选获得可稳定高表达HSA的单克隆细胞株,通过在基础培养基中添加葡萄糖、丁酸钠及补料培养基等方式进行细胞培养工艺优化,以提高HSA表达量;最终在5 L生物反应器上进行放大培养验证。结果成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-HSA,并在全悬浮CHO细胞中实现分泌表达后,又经过2次单克隆筛选,获得高表达HSA的2次单克隆细胞株CHO-rHSA-7H2A9和CHO-rHSA-7H2D12,表达量分别达到29.37和25.26 mg/L;通过培养工艺优化使HSA表达量达到100.00 mg/L左右;最终使5 L生物反应器上HSA表达量提升至166.16 mg/L,与第1次单克隆细胞上清中HSA表达量相比,提高了30倍左右。结论实现了HSA在CHO细胞中的高效表达,为进一步在生物制品领域规模化生产HSA及解决市场供应问题奠定了基础。