重组葡激酶(r-Sak)的分离、纯化和结晶

通过葡激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 ,表达产物 r- Sak以可溶性、活性状态存在于胞浆内。本文报道用离子交换和凝胶过滤纯化 r- Sak的简易路线 ,从每升发酵液可得纯度 98%以上 ,比活性 10万 HU/ mg的 r- Sak30 0 mg以上 ,比国外报导道 6倍。r- Sak的理化特性和 N末端 15个氨基酸顺序与天然 Sak十分相似。利用纯化的 r- Sak已成功地制备了晶体。

光化学法诱导大鼠冠状动脉血栓模型的建立和应用

目的建立光化学法诱导大鼠冠状动脉血栓致心肌梗死模型。方法大鼠分为激光和化学单独刺激组、联合刺激组和重组葡激酶处理组,通过注射光敏剂四氯四碘荧光素二钠(虎红)后激光照射冠状动脉形成血栓致心肌梗死动物模型,比较各组血管栓塞程度以及心电图Ⅱ导联ST段高度变化选择出最佳模型。并用该模型评价重组葡激酶溶栓作用效果。结果相对于单独刺激组,联合刺激组心脏激光照射处均出现明显损伤病灶。HE染色心肌细胞肿胀,排列紊乱,动静脉内均见血栓。心电图出现不同程度心律失常,ST段抬高。其中注射40 mg.kg-1虎红后照射15 min心律失常出现时间较早,心电图ST段抬高幅度高、维持时间长,而且死亡率低,为本研究中最佳光化学法冠状动脉血栓模型。重组葡激酶处理组能够部分溶解动静脉血管内血栓,减小血栓面积(P<0.01),抑制ST段抬高(P<0.05～0.01)。结论该文建立了最佳光化学法诱导大鼠冠状动脉血栓模型,适于溶栓药物研发评价。

注射用重组葡激酶的中试研究

在已获得了高效表达重组葡激酶工程菌的基础上建立了快速、高效的注射用重组葡激酶中试生产规程。工程菌经机械破碎和离心后，上清液经硫酸铵分级沉淀，一步凝胶过滤和一步阴离子交换即可获得高纯度、高活性的半成品，加入稳定剂后过滤除菌、分装、冻干即得成品。蛋白质回收率和活性回收率均为４０％以上，由于选用径向色谱柱，色谱参数可直接放大至工业化生产。

^125I—血栓致兔肺栓塞模型评价药物溶栓作用方法的改进和应用

目的 探索急性和较长时间溶栓作用的可靠评价方法。方法 改进12 5I 血栓致兔肺栓塞模型和方法 ,用实验结束时肺残留12 5I 血栓放射性评价重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rt PA)、重组葡激酶 (rSak)及复方益心康的急性溶栓作用 ;并用本模型和累积尿12 5I 放射性排泄率对益心康进行较长时间动态溶栓研究。结果 3个急性实验中 ,生理氯化钠溶液组的溶栓率在6 %～ 8% ;放射性总回收率为 90 %～ 97% ;rt PA和rSak均有剂量依赖性的明显溶栓作用 ;益心康无明显纤溶作用。较长时间实验中 ,肺栓塞后 0～ 7.5d ,益心康组累积尿12 5I 放射性排泄率明显高于生理氯化钠溶液对照 ;放射性总回收率为 97%～10 5 %。结论 本模型和方法的自发溶栓率低 ,肺残留12 5I 栓子和总放射性回收率高 ,结果可信度高。本模型和累积尿12 5I 放射性排泄率可作为动态观察与评价较长时间溶栓作用的可靠方法。

重组葡激酶活性测定参考品的研制

按照标准品的要求研制了重组葡激酶活性参考品 ,经检测外观、无菌、水份等各项指标均符合标准品的要求 ,其活性经过 15次标定 ,结果为 (10 10± 191) U/ dose,变异系数为 19%。本品稳定性良好 ,可以作为重组葡激酶活性测定参考品。

不同免疫方法制备抗血清的效果比较

目的 比较不同免疫方法制备抗血清的效果以选取最佳免疫程序。方法 以菊糖 C3 复合物和重组葡激酶分别作为颗粒性和可溶性抗原 ,采用多种途径对 2 0只家兔进行免疫 ,并采用琼脂免疫扩散法测定抗血清的滴度。结果 多点肌肉、淋巴结和皮内注射所获抗血清的平均几何滴度分别为 1∶2 2 .6、1∶11.3和 1∶8。结论 多点肌肉注射是一个好的免疫程序。

重组葡激酶动脉内溶栓治疗犬急性脑梗死的量效研究

目的比较动脉内注射不同剂量重组葡激酶(r-Sak)溶栓治疗犬急性脑梗死的疗效和并发症,以探讨其相对合理的治疗剂量。方法成年比格犬24条,用介入技术建立犬脑栓塞动物模型,随机分为对照组(生理盐水10 ml)、小剂量组(r-Sak 5 000 u/kg)、中剂量组(r-Sak 10 000u/kg)和大剂量组(r-Sak 20 000 u/kg)。栓塞后5 h行脑血管造影观察所栓塞血管的通畅情况,插管至左颈内动脉分别在30 min内注入药物行溶栓治疗,在溶栓后0．5、1及2 h复查DSA,观察栓塞血管的再通情况,并分别在溶栓前0．5 h、溶栓后0．5 h、1 h及2 h抽取犬静脉血检测PT、APTT和D-二聚体。24 h后处死动物行病理检查。结果溶栓后2 h内造影显示对照组、r-Sak小剂量、中剂量和大剂量组的有效率分别为10．0%(1/10)、40．0%(4/10)、90．9%(10/11)和100%(9/9),各组间比较有显著性差异(P＜0．001);完全通畅的比率分别为0、10%(1/10)、36．4%(4/11)、66．7%(6/9),也有统计学差异(P=0．005)。溶栓后PT、APTT在r-Sak各剂量组均显著延长(P＜0．001);各组的D-二聚体在溶栓前后没有明显变化(各组P＞0．05)。溶栓后r-Sak大剂量组有1例死亡,病理检查在其顶叶脑实质见出血灶,其余动物均存活。结论①在犬脑梗死的超急性期,r-Sak动脉内溶栓治疗有效、可行,r-Sak对含少量血小板的白色血栓有显著溶栓作用,剂量大或等于10 000 u/kg时血管再通率高,剂量再增加出血风险加大;②r-Sak在有效剂量范围内不激活犬的系统纤溶,但对犬的凝血系统影响较大。

重组葡激酶静脉溶栓治疗对急性心肌梗塞患者血小板活化的作用

目的:通过与重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)对比,观察重组葡激酶(r-SAK)对急性心肌梗塞(AMI)患者溶栓治疗前后血浆中血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)含量的影响,评价其对AMI对凝血系统的影响和对血小板活化的作用。方法:选择确诊为AMI发病12 h以内患者33例,随机分为r-SAK治疗组(n=17)和rt-PA对照组(n=16),测定两组溶栓治疗前、溶栓后2 h血浆中GMP-140、TAT含量及溶栓90 min后冠脉造影等相关指标。结果:两组溶栓治疗后血浆中GMP-140含量均高于治疗前(P<0.05);与r-SAK组溶栓治疗后比较,rt-PA组溶栓治疗后血浆中GMP-140含量显著升高(P<0.05),r-SAK组溶栓治疗后2 h血浆中TAT浓度略有升高(P>0.05),rt-PA组溶栓治疗后2 h血浆中TAT浓度显著升高(P<0.05)。两组溶栓治疗后再灌注率无明显差异。结论:AMI患者应用r-SAK与rt-PA溶栓治疗有同等的溶栓疗效,r-SAK较rt-PA有更强的血栓选择性,促凝活性微弱,促血小板活化低,减轻血栓前状态对心肌损伤作用,可以改善心肌微灌注。

基因重组葡激酶和重组链激酶在猪急性脑栓塞模型中溶栓作用的比较研究

目的：比较局部动脉内灌注重组葡激酶和重组链激酶对脑血栓的溶化效果及对出凝血系统的影响。方法：制成１８只幼猪急性血栓性脑栓塞模型，４小时后分３组，２个实验组自颈内动脉灌注重组葡激酶（０．２ｍｇ／ｋｇ）或重组链激酶（３×１０４Ｕ／ｋｇ），对照组自颈内动脉灌注５％葡萄糖；脑血管造影观察血栓是否溶化；并测定凝血系统指标。结果：２个实验组在用药后１．５小时血管再通均高于对照组，葡激酶组在０．５和１．０小时的再通率高于链激酶组（Ｐ均＜０．０５）。葡激酶组对纤维蛋白原、纤溶酶原影响小，凝血酶原时间、凝血酶时间及部分凝血活酶时间延长的幅度小于链激酶组。结论：重组葡激酶及链激酶均能溶化脑血栓，但前者溶栓效果较好。

表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养

采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21（DE3）生产重组葡激酶．水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养条件的初步筛选，采用溶氧反馈的流加补料策略，进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺研究。通过对培养条件的不断优化，重组葡激酶．水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）里得到了高效表达，菌体密度最终达到115g／L（WCW）以上，可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30％以上，含量约为1．1～1．2g／L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养，结果表明该工艺能有效地放大，可适用于工业生产。

重组葡激酶溶栓作用的实验研究

目的 研究重组葡激酶对体内外血栓的溶解作用。方法 采用体外纤维蛋白溶解法，家兔体内纤维蛋白溶解试验，胶原蛋白肾上腺素诱发小鼠体内脑血栓形成模型及静脉结扎形成大鼠下腔静脉血栓模型。结果 重组葡激酶体外给药对纤维蛋白具有显著溶解作用，使家兔血浆优球蛋白溶解时间明显缩短，给药后０－５至２ｈ间血浆鱼精蛋白试验均呈阳性反应，但对血浆纤维蛋白原含量无显著影响；可显著降低脑血栓小鼠死亡率，缩短偏瘫动物的恢复时间；对结扎形成的大鼠下腔静脉血栓湿重有明显降低，给药后血栓所占血管面积明显减少。结论 重组葡激酶具有极显著溶解体内外血栓的作用，等剂量条件下，作用优于尿激酶。

重组葡激酶(r-Sak)在家兔体内的药代动力学研究

家兔静脉注射重组葡激酶(r-Sak)后,经用二室模型(权重系数1/C)计算。结果表明,该药分布相较短,t1/2α约为1.11±0.72 min,消除也快,t1/2β约为8.64±0.21min,但在胆汁及尿液中未测出r-Sak的生物活性。

重组葡激酶对犬股动脉血栓的再通作用

目的 研究重组葡激酶对体内血栓的溶解作用。方法 采用狗股动脉富含红细胞血栓形成模型。结果 重组葡激酶明显减少狗股动脉富含红细胞血栓的长度及湿重，促进栓塞动脉再通，给药后，动脉血流量明显增加，再通率提高。结论 重组葡激酶具有极显著溶解犬实验性动脉血栓的作用，等剂量条件下。

重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。

基因重组葡激酶和重组链激酶溶栓作用的实验研究

目的:比较基因重组葡激酶和重组链激酶对脑血栓的溶化效果及对出凝血系统的影响。方法:制成猪血栓性脑栓塞模型,4h后分组自颈内动脉灌注基因重组葡激酶(rSak,0.2mg/kg)或重组链激酶(rSK,30000IU/kg),脑血管造影观察血栓是否溶化,测定凝血系统指标。结果:两实验组在用药后1.5h血管再通均高于对照组,rSak组在0.5h、1.0h的再通率高于rSK组。rSak组对纤维蛋白原、纤溶酶原影响小,凝血酶元时间、凝血酶时间延长的幅度小于rSK组。结论:基因重组葡激酶及链激酶能溶化脑血栓,但前者溶栓效果较好,对凝血功能影响较小。

重组葡激酶对重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织缺血的影响

目的观察大鼠重症急性胰腺炎（SAP）时血中内皮素-1（ET-1）、血管性假血友病因子（vWF）、6-酮-前列腺素-F1α（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）、血小板最大聚集率（PAGm）水平及胰腺组织血流量的变化，评价重组葡激酶（r—Sak）对其的干预作用。方法81只SD大鼠被随机分为假手术组、SAP模型组和r—Sak治疗组，每组27只。采用质量分数为5％的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立SAP模型。于制模后6、12和18h检测下列指标：用组织血流仪检测胰腺组织的血流量；用放射免疫法检测血中ET-1、TXB2和6-keto-PGF1α含量；用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定血中vWF含量；用全自动血小板聚集仪检测胶原和花生四烯酸诱导的PAGm。结果术后6、12和18h SAP模型组大鼠胰腺组织血流量呈逐渐下降趋势，各时间点胰腺组织血流量均较假手术组显著下降（P均〈0．05），且术后各时间点PAGm及血中ET-1、vWF、TXB2含量均较假手术组显著升高，6-keto-PGF1α显著降低（P均〈0.05）；与SAP模型组比较，r—Sak治疗组术后各时间点PAGm、ET-1、vWF、TXB2含量均显著降低，6-keto-PGF1α则显著升高（P均〈0.05）。结论r—Sak可明显改善SAP大鼠胰腺的微循环，增加胰腺组织的血流量，对SAP大鼠具有积极的治疗作用。

不同剂量重组葡激酶治疗幼猪急性脑梗死对凝血和纤溶功能的影响

目的 研究重组葡激酶 (rSaK)治疗急性脑梗死对血液凝血及纤溶功能的影响。方法 幼猪 48头 ,分为对照组和 7个rSaK组 (剂量 0 4万～ 6 4万IU/kg) ,每组 6头。幼猪脑梗死 4h后静脉用rSaK ,对照组用安慰剂。治疗后 30、60、90min测凝血酶原时间 (PT)、部分凝血活酶时间 (APTT)、凝血酶时间 (TT)、纤维蛋白原 (Fg)、优球蛋白溶解时间 (ELT)、血浆纤溶酶原活性 (Plg :A)、D -二聚体 (DD)。结果 rSaK延长PT、APTT、TT ,缩短ELT ,增加DD ,剂量越大越明显 ,但对Fg、Plg :A影响很小。结论 rSaK能显著增强纤溶活性 ,对血液凝血功能影响较小。

重组葡激酶(r-Sak)工程菌发酵工艺的研究

通过对影响重组葡激酶表达的几个主要因素的研究 ,建立了较为适宜的发酵条件 :接种量 4% ;初始 p H7.2 ;在 A6 0 0 nm=2 .5时加 2 0 %蔗糖诱导 ,诱导后 4～ 5 h收获 ,发酵液上清 r-Sak含量可达到 2 5 0 mg/L以上 ,酶活力可达到 65 0 0 RU/ ml以上 .

重组葡激酶的分离纯化

在构建出高表达、高活性的葡激酶工程菌株的基础上 ,对表达产物进行了分离纯化研究。经离子交换纯化后 ,纯度达 85 %～ 90 % ,回收率为 5 0 %～ 6 0 % ,经凝胶过滤后 ,纯度达 99%以上 ,回收率为 6 0 % ,经SDS PAGE测定 ,相对分子质量为 15 .5× 10 3,比活为 1.0× 10 5。

重组葡激酶对ICR小鼠的致畸作用研究

目的 :用ICR小鼠研究重组葡激酶 (r-SAK)的致畸作用。方法 :ICR小鼠于妊娠第 6- 1 5d静脉注射r -SAK ,剂量为1 0 0mg/kg .bw、31 .6mg/kg .bw、1 0mg/kg .bw ,同时设立阴性对照组和阳性对照组 ,于孕第 1 8d处死动物 ,进行各项检查。 结果 :各剂量组孕鼠增重、活胎率、胎鼠体重、身长及尾长与阴性对照组比较 ,差异皆无显著性 (P >0 .0 5) ;各剂量组胎鼠外观、内脏和骨骼均无畸形发现。结论 :在本实验条件下 ,r-SAK对ICR小鼠无致畸作用。