PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用SUMO酶切除SUMO-His标签,获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后,先将带有attP TT-DsRed2-attP CT片段的“着陆点”(landing pad,LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞,然后进行第二次电穿孔,将带有attB TT-EGFP-HiBiT-attB CT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞,验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导,该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白,经亲和层析纯化,SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白均成功触发了pBCPB+质粒attP和attB位点之间的重组反应,重组效率基本一致(50%vs.52%);以脂质体转染法将PhiC31真核表达质粒pCMVInt与LP质粒和donor质粒共转染DF-1细胞,荧光显微镜观察证实了DsRed2-EGFP置换现象;以电穿孔方式将LP质粒、donor质粒和PhiC31蛋白先后导入DF-1细胞,获得了相同结果,表明PhiC31蛋白引发了attP TT与attB TT、attP CT与attB CT之间的重组反应。通过原核表达获得的PhiC31蛋白具有生物活性,有望成为一种重要试剂而用于Easi-CRISPR-TARGATT介导的转基因鸡研究。

重组酶介导的定点整合及在构建重组CHO细胞中的应用

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)是生产治疗性重组蛋白最常用的细胞。随机整合(random integration,RI)工艺是目前构建重组CHO细胞株的主要策略,由于CHO细胞基因组缺乏稳定性,为得到产量高、品质好且适应特定工艺的细胞株,通常需要1~2轮高通量筛选,不仅工作量大、耗时长且批次稳定性差。定点整合(site-specific integration,SSI)基因编辑技术将外源基因整合至细胞基因组的特定位点,经一轮筛选得到稳定、高产且适应特定生产工艺的细胞株,从而缩短细胞株构建周期。近年来,不断有将定点整合策略应用于构建重组CHO细胞株的报道。基因编辑技术的发展是实现细胞外源基因定点整合工艺的基础,常用的基因编辑技术包括核酸酶技术、转座子技术和重组酶技术。比较这三种基因编辑技术在构建流程、整合效率和专利等方面的不同特点,重点讨论重组酶介导的定点整合及其在CHO细胞株构建中的应用。