壳寡糖浸种对低温下江西铅山红芽芋脱毒试管芋萌发及生理代谢的影响

江西铅山红芽芋脱毒试管芋一般在1月至2月上旬晴天播种,“倒春寒”等低温胁迫会导致早播的江西铅山红芽芋脱毒试管芋生长缓慢,出苗周期变长,严重时会造成烂种死亡,出苗率降低,影响其产量。为提高播种期江西铅山红芽芋脱毒试管芋抗寒性,该研究利用植物组织培养和植物生理学的方法测定了壳寡糖浸种后低温下江西铅山红芽芋脱毒试管芋的萌发及其相关生理指标。结果表明:200~250 mg/L壳寡糖浸种可显著促进低温下江西铅山红芽芋脱毒试管芋的萌发。与低温对照相比,当浸种浓度为200 mg/L时,在内源激素方面,有利于低温下江西铅山红芽芋脱毒试管芋萌发过程中赤霉素、玉米素核苷、多胺和茉莉酸的积累,而不利于生长素和脱落酸的积累;在抗氧化方面,提高了超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性,降低了丙二醛和过氧化氢的含量;在渗透调节方面,有利于可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的积累;在代谢关键酶方面,可提高脂肪酶、蛋白酶和α-淀粉酶活性以及三磷酸腺苷含量。因此,200 mg/L壳寡糖可以调控低温下江西铅山红芽芋脱毒试管芋内源植物激素和渗透调节物质含量、抗氧化酶和代谢关键酶活性,促进其在低温下的萌发。

江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存

为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源,本文以江西铅山红芽芋的胚性愈伤组织为对象,研究了包埋玻璃化冻存过程中各因素对细胞活力和愈伤组织成活率的影响,优化建立了江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存体系。将约0.2 g胚性愈伤组织块包埋成海藻酸钙凝胶珠后,在25℃下转入MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L NAA+0.75 mol/L蔗糖的培养基中于14 h/d光周期下预培养1 d;预培养后的胚性愈伤组织块用2 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的混合物在25℃下装载40 min;采用PVS2在25℃下脱水30 min,更换PVS2后直接投入液氮保存1 d;再将胚性愈伤组织块置于37℃恒温水浴中化冻3 min,然后用MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L NAA+1.2 mol/L蔗糖的液体培养基洗涤3次,每次10 min;洗涤后的胚性愈伤组块转入MS+2 mg/L TDZ+1mg/L NAA固体培养基上先暗培养7 d再转到14 h/d光周期中培养。7 d后胚性愈伤组织块开始恢复生长,并且在30 d内分化出胚状体;将胚状体再次转入MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L NAA固体培养基上,60 d后形成完整的植株。红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为60%,并且红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗没有发生形态性状和染色体数目的变异,此结果为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源奠定了良好的基础。

江西铅山红芽芋胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存技术的研究

探索江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的小滴玻璃化法超低温保存,为其种质资源的超低温保存提供技术基础和理论依据。植物组织培养和单因子试验的方法。江西铅山红芽芋胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的较佳程序为:约0.2 g胚性愈伤组织在25℃下转入MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA+0.5 mmol·L-1蔗糖的培养基中,于14 h·d-1光周期下预培养3 d后用MS+2 mmol·L-1甘油+0.4 mmol·L-1蔗糖在25℃下装载20min,然后用PVS2在0℃下脱水40 min,吸取5滴PVS2到铝箔条上,将脱水后的红芽芋胚性愈伤组织块转到铝箔条上的PVS2液滴里。附有胚性愈伤组织块的铝箔条在液氮里蘸一下,然后迅速将其转入2 mL装满液氮的冷冻管中,再投入液氮保存1 d。从液氮中取出冷冻管中的铝箔条,浸入用40℃温水预热过的洗涤液(MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA+1.2 mmol·L-1蔗糖)中,使胚性愈伤组织块从铝箔条上脱落下来,然后再将胚性愈伤组织块转入新鲜的洗涤液中洗涤3次,每次10 min。洗涤后转入MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA固体培养基上,先暗培养7 d再转到14 h·d-1光周期中培养。30 d后将分化出的胚状体再次转入MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA固体培养基上可再生完整植株。红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为80%。红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗没有发生形态学、生理学和细胞学的变异。红芽芋胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存可以保证其遗传资源的稳定性,为江西铅山红芽芋种质资源的离体保存提供了一条新的途径。

江西铅山红芽芋再生苗遗传稳定性的RAPD分析和流式细胞术检测

通过RAPD分子标记和流式细胞术来分析和检测江西铅山红芽芋再生苗的遗传稳定性,为其种质资源的离体保存和试管苗的工厂化生产提供理论依据。结果表明,经流式细胞术检测,江西铅山红芽芋9种再生苗与对照组的第1个主峰对应的荧光强度值和第2个峰所对应的荧光强度无显著变化。通过20条随机引物对江西铅山红芽芋9种再生苗与对照组进行RAPD扩增。扩增出来的片段大小为200~3 000 bp,20条引物的扩增位点数分别为12,10,7,8,9,14,9,14,10,8,10,10,10,10,11,8,9,10,8,15,共获得202个位点,平均每个引物获得10.1个位点,其中160个为可重复的多态性位点,平均每个引物检测到的多态性位点数为8个,平均多态性位点百分率为79.21%。用NTsys2.10软件对9种再生苗与对照组进行聚类分析,9种再生苗与对照组分成了两类,一类只有1种,即愈伤组织再生苗,另一类包括8种再生苗和对照组。表明愈伤组织再生苗与其他8种再生苗和对照组比较具有显著差异,而其他8种再生苗和对照组之间差异不显著。

红芽芋球茎片两步法离体快繁及其再生苗生理和光合特性研究

以江西铅山红芽芋(Colocasia esculenta L.Schott var.cormosus‘Hongyayu’)试管苗为材料,建立了芋球茎片两步法离体快繁体系,并对其再生苗的形态指标、染色体数目、生理和光合特性以及叶绿素荧光特性进行了检测。结果表明:(1)红芽芋球茎片单芽诱导的最佳培养基为MS+KT 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA0.1mg/L,诱导培养30d后将单芽从球茎片上分离,再接种到生根培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.1mg/L)上培养30d即可形成完整植株,移栽成活率高达98%;(2)由球茎片单芽、丛生芽、不定芽离体快繁获得的红芽芋再生苗在形态指标、叶下表皮气孔参数、染色体数目、生理生化指标以及叶片光合特性参数和叶绿素荧光特性方面均无显著差异。说明红芽芋球茎片两步法离体培养的再生苗繁殖系数高、染色体数目稳定,该离体快繁体系可应用于江西铅山红芽芋的工厂化生产。

红芽芋驯化苗对盐胁迫的光合及生理响应

为探讨江西铅山红芽芋的耐盐机制，以其组培移栽驯化苗为材料，研究了盐胁迫对其生物量积累、光合特性、荧光特性等抗逆生理特性的影响。结果表明：（1）红芽芋幼苗生物量和根冠比在低盐胁迫下（50mmol·L^-1）得到显著促进，而在高盐胁迫下（100～250mmol·L^-1）受到显著抑制。（2）低盐胁迫幼苗的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、气孔限制值（Ls）、水分利用效率（WUE）和瞬时羧化效率（CUE）比对照（0mmol·L^-1）显著增加，细胞间CO2浓度（Ci）比对照显著下降，蒸腾速率（Tr）与对照无显著差异；高盐胁迫幼苗的Pn,Ls、WUE、CUE和Gs较对照显著下降，Ci比对照显著增加。（3）低盐胁迫幼苗的最大荧光（Fm）、PSⅡ潜在光化学效率（Fv／F0）和光化学猝灭系数（qp）比对照显著增加，初始荧光（F0）较对照显著下降，PSⅡ最大光化学效率（Fv／Fm）、PSⅡ实际光化学效率（ФPSⅡ）、开放的PSⅡ反应中心捕获激发能效率（Fv’／Fm’）和非光化学猝灭系数（NPQ）与对照无显著差异；而高盐胁迫幼苗的F0,Fm,Fv／Fm、Fv／F0、ФPSⅡ、Fv’／Fm’和qp均较对照显著下降，NPQ比对照显著增加。（4）各盐胁迫幼苗叶片的可溶性蛋白含量以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性与对照相比先升后降，并以低盐下最高；可溶性总糖和脯氨酸含量均比对照显著增加；丙二醛含量和质膜透性相对值在低盐胁迫下无显著变化，而在高盐下显著增加；叶绿素含量和根系活力在低盐胁迫下无显著变化，而在高盐胁迫后开始显著下降。研究发现，江西铅山红芽芋移栽驯化苗的耐盐阈值为50mmol·L^-1，其能够诱导提高叶片可溶性蛋白含量和主要保护酶活性，稳定质膜透性、叶绿素含量和根系活力，增加PSⅡ潜在光化学效率，提高PSⅡ的电子传递活性，维持PSⅡ实际光化学效率，有效启动非辐射热能量耗散机制来保护了光合机构，最终提高净光合速率，增加生物量。

江西铅山红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织诱导及其再生体系的建立

以江西铅山红芽芋脱毒苗为试材，研究不同因素对红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织诱导及其再生体系的影响，以期对红芽芋脱毒苗的再生体系进行优化。结果表明，红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织诱导的最佳培养基是MS＋TDZ2mg·L。＋2，4-D1mg·L-1红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织分化的最佳培养基是MS＋TDZ2mg·L。＋NAA1mg·L-1红芽芋脱毒苗不定芽生根的最佳培养基是1／2MS＋NAA0．5mg-L-1＋PP。0．5mg·L-1红芽芋再生苗最好的移栽基质为发酵后的腐锯木屑。红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织再生苗移栽时最佳的PP。浓度为20～50mg·L-1。本试验成功建立了红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织的再生体系，为红芽芋脱毒苗转基因的研究和种质创新奠定了基础。

江西铅山红芽芋试管苗对盐胁迫的生理响应

以江西铅山红芽芋试管苗为材料,研究其对盐胁迫的生理响应。结果表明:(1)低浓度的Na Cl(如1、2.5 g/L)有助于试管苗的生长发育,试管苗鲜重和干重显著增加,但对根冠比无显著影响。而高浓度的Na Cl(如5、10、15 g/L)则抑制了试管苗的生长发育,试管苗鲜重、干重和根冠比明显下降。(2)低浓度的Na Cl(如1、2.5 g/L)有利于增加叶绿素和可溶性蛋白含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性。但高浓度的Na Cl(如5、10、15 g/L)则降低叶绿素和可溶性蛋白含量,降低SOD和POD活性。(3)任何浓度的Na Cl胁迫均会导致红芽芋叶片Na+含量和根系K+含量的增加,且叶片和根系的Na+/K+也随Na Cl浓度增加而升高。(4)任何浓度的Na Cl胁迫均会造成红芽芋试管苗叶片可溶性糖和脯氨酸含量的增加。低浓度的Na Cl胁迫不会造成红芽芋试管苗叶片丙二醛(MDA)含量和细胞质膜透性的变化,但高浓度的Na Cl胁迫会造成红芽芋试管苗叶片MDA含量和细胞质膜透性的增加。脯氨酸含量与可溶性总糖含量、MDA含量和质膜透性间呈显著的正相关,表明盐胁迫下脯氨酸积累的多少可反映红芽芋试管苗的伤害程度。

江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻璃化法超低温保存及植株再生

以江西铅山红芽芋胚性愈伤组织为材料,研究各种因素对其玻璃化法超低温保存的影响。结果表明:江西铅山红芽芋胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存较佳的预培养条件为0.3mol·L-1蔗糖预培养3d,较佳的60%PVS2装载时间为20min,较佳的100%PVS2脱水条件为25℃脱水30min,较佳的化冻温度为40℃,较佳的洗涤液蔗糖浓度为1.2mol·L-1,较佳的冻后培养条件为暗培养7d再转到光周期中培养。红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为70%。红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗没有发生形态学、生理学和细胞学的变异。

江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒苗的转录组分析

【目的】探究江西铅山红芽芋对超低温疗法脱毒的转录组响应机制,为江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒苗的规模化应用奠定理论依据。【方法】以江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒苗(VF组)和江西铅山红芽芋超低温疗法带毒苗(V组)试验材料进行转录组比较分析。【结果】VF组Clean reads为42 406 188,GC含量为54.09%;V组Clean reads为46 818 060,GC含量为50.36%。VF组和V组表达量FPKM的对数值在0~2,表达量密度在0~0.8。VF组和V组表达的共有基因数为23 820,V组单独表达的基因数为10 298,VF组单独表达的基因数为4 477。VF组和V组表达量的相关系数为0.287,样本间相关性较差。VF组和V组共产生差异表达基因5 282个,与V组比较,VF组上调基因3 011,下调基因2 271。GO富集分析显示,差异基因主要注释到过氧化氢分解过程、过氧化氢代谢过程、一元羧酸生物合成过程、多糖分解代谢过程、金属离子输运、细胞外区、细胞壁、外部封装结构、膜的固有成分、质膜固有成分、核酸结合转录因子活性、序列特异性DNA结合转录因子活性、单加氧酶活性、铁离子结合、血红素结合等功能。KEGG富集分析显示,差异基因主要注释到苯丙酸生物合成、类黄酮生物合成、二苯乙烯类和二芳基庚烷类以及姜辣素的生物合成、MAPK信号通路-植物、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、植物激素信号转导、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、过氧化物酶体、α-亚麻酸代谢、苯丙氨酸代谢、氰胺酸代谢、类胡萝卜素生物合成、异喹啉生物碱的生物合成、泛醌和其他萜类醌的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、植物昼夜节律、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等途径。【结论】F-box家族蛋白、脱落酸受体PYR1、乙烯受体2、生长素响应因子1、BZIP转录因子家族蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、植物抗病反应蛋白、抗病蛋白、抗病蛋白RPS2、抗病蛋白RPS5、抗病蛋白RGA2、抗病反应蛋白、转座子TNT的逆转录病毒相关Pol多蛋白、逆转录病毒相关Pol多聚蛋白系1、类烟草病毒增殖蛋白3、烟草病毒增殖蛋白1、转座子RE1的逆转录病毒相关Pol多蛋白、蔗糖合成酶等基因是江西铅山红芽芋的超低温疗法脱毒的主要响应基因。

江西铅山红芽芋和青秆芋的转录组比较分析

为探究江西铅山红芽芋和江西铅山青秆芋之间的分子差异,以江西铅山红芽芋(HYY组)和江西铅山青秆芋(QGY组)的试管苗为试验材料进行转录组分析。结果表明:HYY组Clean reads为41298676,GC含量为53.09%;QGY组Clean reads为45551860,GC含量为51.17%。HYY组和QGY组表达量FPKM的对数值在0~2,表达量密度在0~0.7。HYY组和QGY组表达的共有基因数为14038,HYY组单独表达的基因数为17843,QGY组单独表达的基因数为18634。HYY组和QGY组表达量的相关系数为0.035,样本间相关性较差。HYY组和QGY组共产生差异表达基因32555个,与QGY组比较,HYY组上调基因15887,下调基因16668。GO富集分析显示,差异基因主要注释到多糖代谢过程、基因沉默、果胶分解代谢过程、碳水化合物代谢过程、生长素激活的信号通路、细胞外区、膜的固有成分、膜的组成成分、膜部件、凋亡细胞、作用于糖基键水解酶活性、水解O-糖基化合物的水解酶活性、蛋白质二聚活性、DNA结合、氧化还原酶活性对二酚及其相关物质的作用等功能。KEGG富集分析显示,差异基因主要注释到植物激素信号转导、植物病原相互作用、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、苯丙酸生物合成、皮质醇合成与分泌、过氧化物酶体、植物MAPK信号途径、不匹配修复、淀粉和蔗糖代谢、硫代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、C型凝集素受体信号通路、甘油酯代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢、二萜生物合成、类黄酮生物合成、脂肪酸延长、光合作用、吲哚生物碱生物合成等途径。

江西铅山红芽芋芋病毒种类lncRNA测序鉴定及其序列分析

探究江西铅山红芽芋的主要病毒种类及其序列信息,为其脱毒苗培育提供依据。采用lncRNA测序技术确定江西铅山红芽芋的病毒种类,并利用RT-PCR技术、生物信息学分析软件和qRT-PCR技术进行病毒验证、序列分析和组织表达分析。江西铅山红芽芋检测到芋花叶病毒(DsMV)和花椰菜花叶病毒(CaMV)两种病毒;DsMV和CaMV基因cDNA总长度分别为1780 bp和5412 bp,分别编码592和1803个氨基酸;DsMV和CaMV多聚蛋白二级结构均由α螺旋、β-片层、无规则卷曲构成,其三级结构均为单体蛋白;DsMV和CaMV在江西铅山红芽芋根、茎、叶中均有侵染,但均在叶中表达量最高。明确了侵染江西铅山红芽芋的主要病毒种类,并首次在江西铅山红芽芋上检测到CaMV。

江西铅山红芽芋试管苗染色制片技术优化研究

以江西铅山红芽芋试管苗为材料,探讨不同取材部位、不同预处理剂、不同酸解离时间和不同改良卡宝品红染色时间对江西铅山红芽芋试管苗染色体制片的影响,以期为江西铅山红芽芋的起源、演化及遗传育种提供一定理论依据。结果表明,切取江西铅山红芽芋试管苗根尖,在室温下用0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-羟基喹啉混合溶液预处理4h,然后在60℃条件下用1 mol/L盐酸解离15 min,最后用改良卡宝品红染色5 min,此时染色体制片效果最佳。

脱毒红芽芋试管芋盆栽种植的农艺性状分析

本研究对江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒试管芋的盆栽种植进行农艺性状分析。结果表明,经SSR检测,江西铅山红芽芋未脱毒试管芋盆栽苗的遗传稳定性未发生变化;超低温疗法脱毒可以提高江西铅山红芽芋脱毒试管芋盆栽苗的地上部长势,促进植株长高,增加单株茎叶鲜重;可以提高江西铅山红芽芋脱毒试管芋盆栽苗的叶绿素含量和根系活力,从而间接促进了其光合作用和干物质的积累;可以提高江西铅山红芽芋脱毒试管芋盆栽苗的净光合速率Pn、气孔导度Gs、细胞间CO2浓度Ci、蒸腾速率Tr、气孔限制值Ls、水分利用效率WUE和瞬时羧化速率CUE,显著促进其光合效率;还可以增加江西铅山红芽芋脱毒试管芋的单株芋重、单株芋数和芋产量,降低平均芋仔重,具有显著的增产效应。本试验结果可为江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒试管芋规模化繁育和大田种植提供参考依据。

红芽芋低温疗法脱毒苗遗传变异的AFLP检测

为探明红芽芋低温疗法脱毒苗的遗传变异,本研究利用AFLP荧光标记和毛细管电泳分离技术对其进行分析。研究表明,利用10对引物组合对江西铅山红芽芋4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本进行扩增,扩增后的多态性位点数在49~70范围之内。多态性百分率最低是E36M72,为89.23%,多态性百分率最高是E59M66,为100%;观测等位基因数Na在1.892 3~2.000 0的范围之内,有效等位基因数Ne在1.616 6~1.908 2的范围之内;Nie's基因多样度H的范围为0.357 4~0.473 8,Shannon信息指数I的范围为0.526 8~0.666 2;依据其荧光AFLP扩增结果进行编码组合,构建了江西铅山红芽芋AFLP组合编码指纹图谱。4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本均出现了AFLP变异位点,每个样本变异位点平均出现的数量为8.73~23.30;4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本的遗传相似系数为0.471 8~0.796 2,样本间的相似度不是很高,低温疗法脱毒存在一定程度上的变异。在遗传相似系数0.605 1处,4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本被分为4大类。第Ⅰ类包括样本1和样本30,第Ⅱ类包括样本27和样本29,第Ⅲ类包括样本26和样本28,剩下的样本均归于第Ⅳ类。表明低温疗法脱毒造成了江西铅山红芽芋一定程度的遗传变异。本试验结果为江西铅山红芽芋茎尖低温疗法脱毒提供一定的理论依据。

江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗遗传稳定性的SSR检测

为了检测江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗是否存在遗传变异,本研究采用SSR分子标记技术与毛细管电泳技术相结合的方法来检测江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗的遗传稳定性。结果表明,根据PAGE检测从38对引物中选出10对引物(P10,P11,P18,P23,P24,XP3,XP5,XP7,XP8,XP10);10对引物的30个样本(包括低温疗法脱毒苗和大田苗)分型基本相同,且其多样性指数较低,观测纯合度和期望纯合度也均高于观测杂合度和期望杂合度;30个样本的遗传距离大部分均为0,少量为0.032 3、0.033 9或0.198 6,遗传相似系数大部分均为1,少量为0.968 2,表明遗传分化程度极低;按照UPGMA法进行聚类分析,30个样本聚为一类。以上研究表明,江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗无遗传变异,低温疗法脱毒可保证其遗传稳定性。本研究可为江西铅山红芽芋低温疗法脱毒提供遗传稳定性方面的依据。