Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展 ,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成 :Exo蛋白是一种核酸外切酶 ,结合在双链DNA的末端 ,从 5′端向 3′端降解DNA ,产生 3′突出端 ;Beta蛋白结合在单链DNA上 ,介导互补单链DNA退火 ;Gam蛋白可与RecBCD酶结合 ,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短 ( 4 0～ 60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作 ,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外 ,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上 ,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 。

Red重组技术研究进展

主要从Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术，指出了其中的缺陷。然后提出了Red重组技术的定义：利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法，外源线性DNA通常是PCR产物、寡核苷酸片断等，在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40—60bp。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切和连接等步骤，使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单，逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.

Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用

通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一个传统型基因敲除打靶载体的构建;结合Cre-loxP系统,在传统型基因敲除打靶载体的基础上,经过再一轮的Red/ET重组就能够成功实现条件性基因敲除打靶载体的构建。整个实验过程不需要PCR扩增长、短臂序列,也不涉及酶切、连接反应,因此,不仅省时、省力,而且所构建的基因打靶载体序列准确,无突变。实验方法的建立为加速后基因组时代的基因功能研究提供了一条捷径。

Red/ET系统研究进展及在微生物研究中的应用

传统的基因工程技术现已经不满足于后基因组时代的生命科学研究。新的同源重组系统-Red/ET系统具有所需同源臂短(35—60 bp),重组效率高等特点,通过诱导recE/recT或redα/redβ完成重组,可以采用各种策略对目标基因进行插入、敲除、点突变等一系列修饰操作,并且不需限制性内切酶和连接酶的作用。文章针对Red/ET系统的产生背景、原理、系统改进和应用作一阐述,并对Red/ET在微生物研究中的应用作了举例。

利用PCR产物快速构建免HPRT基因无启动子打靶载体

目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法，为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT）基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上，利用Red重组系统，从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上，产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒，通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt／Neo／Frt同源重组片段，最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定，表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。

利用Red重组系统快速构建基因打靶载体

基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一。利用常规的分子克隆的方法构建基因打靶载体往往工作周期长,对于难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建。通过合理应用Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆了长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了Gpr56等基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,实现了打靶载体的快速构建。