养殖大黄鱼“白鳃病”一种新病毒病原的初步研究

运用组织病理学、电镜观察及PCR扩增等方法对近年来网箱养殖大黄鱼暴发的"白鳃病"进行了研究,以探讨引起养殖大黄鱼"白鳃"关联病毒的致病机理。临床解剖观察显示:患"白鳃病"的鱼表现出极度的贫血症状、鳃丝苍白色、血液稀薄且血细胞数显著减少;内脏组织病理观察结果显示:鱼的肝、脾、肾脏内脏组织发生严重的病理变化,组织内红细胞发生明显的退行性变化,同时鱼体的红细胞数量显著减少;采用针对真鲷虹彩病毒(red sea bream iridoviral virus,RSIV)的引物对病鱼内脏组织核酸样本进行PCR检测,结果显示,患"白鳃病"病鱼样本RSIV核酸呈阴性;组织超薄切片电镜观察结果显示:在患"白鳃病"病鱼脾脏和肾脏组织细胞的胞质中可见直径约40~45 nm的病毒粒子。由此初步判断,浙江地区网箱养殖大黄鱼的"白鳃病"不是由RSIV导致,而与一种直径为45~50 nm的病毒有直接关联,本研究为大黄鱼疾病的诊断与防治提供了参考依据。

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea breamiridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Pri mer Express3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.1841gX+40.270,相关系数R2=0.9969。熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃。该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性。利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析。

山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析

2008年11月～2010年11月,采集山东海域大菱鲆、石鲽、鲈鱼各20批,按照世界动物卫生组织推荐的PCR检测方法对真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridoviral Disease,RSIVD)进行初步调查。结果显示,共检出4例RSIVD感染样品。以真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus,RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)主要衣壳蛋白基因为基础,设计简并引物,PCR扩增本次检出阳性样品的RSIV/ISKNV MCP基因。将MCP基因PCR扩增产物测序,提交GenBank,并以MCP基因为基础,对被检出的阳性样品进行虹彩病毒属系统分类,绘制进化树。由进化树得出,4例阳性病毒株均属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属。

真鲷虹彩病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种检测真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增(LAMP)方法,满足口岸、养殖场对该病的快速监测的需求,本研究比对分析了Gen Bank中公布的真鲷虹彩病毒基因组序列,筛选其主要衣壳蛋白MCP基因保守区序列,进行LAMP引物设计,建立了真鲷虹彩病毒LAMP检测方法。对扩增条件进行优化,确定最佳反应条件为62℃,45 min。灵敏度试验结果显示,该方法最低检测限为100拷贝/μL目的基因。特异性试验结果显示,该方法不与流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙病毒3型(FV3)、甲鱼虹彩病毒(STIV)发生交叉反应。结果表明,本研究建立的LAMP方法具有良好的敏感性和特异性。对5份疑似真鲷虹彩病毒感染的临床样品进行检测,发现检测结果与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR方法检测结果符合率为100%。研究表明,本方法具有灵敏度高、特异性强,以及仪器设备简单、操作便捷、结果直观等优点,非常适合作为初筛手段,应用于养殖场、口岸等一线的疫病监测。

一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限最低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。

液相芯片技术同时检测真鲷虹彩病毒和锦鲤疱疹病毒方法的建立

为建立一种同时检测真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中真鲷虹彩病毒的CP基因和锦鲤疱疹病毒的TK基因进行序列分析,设计真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰,与荧光编码微球偶联后与真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。试验结果表明,液相芯片检测体系能够正确的检测出真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒。真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒病毒核酸的最低检出量为10pg和100pg,检测特异性高,说明初步建立了同时检测真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒的液相芯片技术,为进一步构建其他水生动物病原体快速高通量检测平台奠定基础。

真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

2017年8月,山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathuspunctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示,养殖海域水温为26℃~28℃;病鱼为4~5月龄,全长为(16.3±1.6) cm,体重为(156.9±37.0) g;80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上,经济损失惨重。临诊检查发现,病鱼体表无明显损伤,但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎,肾糜烂,肝有出血点。组织切片观察发现,病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20μm的肿大细胞,肿大细胞内含有大量直径约为145nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液,腹腔注射感染健康斑石鲷,感染组14d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状,且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物,从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP),序列比对显示,该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV)RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群,是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡,研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。

真鲷虹彩病毒聚合酶链式反应检测方法的建立

目的:真鲷虹彩病毒一直都被列入在世界卫生组织(OIE)水生动物疫病病原的名录中,故需要对其检测方法进行深入研究,建立操作简单,普遍适用的检测技术手段。方法:本文针对RSIV片段设计了一对特异性引物,对反应体系和反应程序进行筛选和优化,建立了检测RSIV聚合酶链式反应的方法。并且用优化好的反应体系和反应程序对重组质粒p MD18-T-RSIV进行扩增。结果:研究发现该方法特异性强,与IHNV、IPNV、SVCV和VHSV无交叉反应,并且灵敏度高,可以达到0.2pg。结论:成功的建立了真鲷虹彩病毒常规PCR检测方法,可以为真鲷虹彩病毒病的诊断提供理论依据。

鸭绿江斑鳜中真鲷虹彩病毒的分离与鉴定

本实验对患病鸭绿江斑鳜进行病毒检测,将表现典型真鲷虹彩病毒(RSIV)病症状的斑鳜鱼肾脏和脾脏研磨成组织匀浆,采用试剂盒方法提取病毒DNA,并应用PCR方法对两对引物进行扩增获得570 bp和568 bp两条基因片段,将其中的568 bp基因片段连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的RSIV同源性均为99.9%,命名为RSIV-DD。表明本研究在国内首次从淡水鱼斑鳜中分离到RSIV。