Red/ET同源重组介导的基因克隆载体pBACS的构建、鉴定与应用

目的通过Red/ET同源重组技术构建pBACS基因克隆及测序质粒载体。方法以质粒pBAC2015、pET28a为模板设计四对引物,PCR扩增得到四段彼此间有50 bp同源区域的基因片段,分别命名为bac-sop、bac-ori、bac-kan和bac-T7。利用Red/ET同源重组技术,将四段基因片段电转至E.coli GB05-dir感受态中进行线线重组。经酶切、测序验证阳性克隆质粒。此外,对重组质粒pBACS进行稳定性鉴定;利用pBACS分别进行细菌16S rDNA和真菌ITS基因克隆和基因测序。结果酶切和测序的验证结果显示,质粒的大小、元件方向及序列正确;pBACS具有较强的稳定性,适用于作为基因工程的克隆载体;可高效用于细菌16S rDNA和真菌ITS序列的克隆,阳性率为100%。结论成功利用Red/ET技术构建克隆载体pBACS,质粒载体具有稳定性强、重组效率高的特点,在基因克隆和基因测序等方面具有良好的应用潜力。

用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。

Red/ET同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体(BAC)进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节.应用新近优化的Red/ET同源重组技术对目标BAC进行修饰,以pSC101-BAD-gbaA为依托质粒,采用rpsL鄄neo为正/反向筛选系统,可以快速、高效地对BAC进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步BAC修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因Cre为代表的两步BAC修饰在两周内即可完成.通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使pSC101-BAD-gbaA依托质粒在发挥完Red/ET同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后BAC,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台.

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.

Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用

通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一个传统型基因敲除打靶载体的构建;结合Cre-loxP系统,在传统型基因敲除打靶载体的基础上,经过再一轮的Red/ET重组就能够成功实现条件性基因敲除打靶载体的构建。整个实验过程不需要PCR扩增长、短臂序列,也不涉及酶切、连接反应,因此,不仅省时、省力,而且所构建的基因打靶载体序列准确,无突变。实验方法的建立为加速后基因组时代的基因功能研究提供了一条捷径。

通过减毒和Red/ET同源重组构建跨界基因沉默菌株

"跨界基因沉默"技术是一种全新的、跨原核界与真核界的小分子RNA干扰传递技术。该技术构建了一种大肠杆菌,在这种大肠杆菌中转录的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)能够引发真核细胞内特异性基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi),所以此大肠杆菌又被称为"跨界基因沉默菌株"。"跨界基因沉默菌株"具有RNA干扰传递功能,主要得益于"跨界干扰质粒"(trans-kingdom RNAi plasmid,TRIP)。TRIP质粒主要包含inv基因、hly基因以及能够转录shRNA的基因片段。hly基因表达的listeriolysin O蛋白可以帮助细菌逃离真核细胞的吞噬体,但listeriolysin O蛋白是一种重要的毒力因子,对宿主细胞具有一定的损害。为了克服这种缺陷,在hly基因上设计了△PEST和G486D两种减毒突变。同时,为了使减毒后的TRIP质粒能够在"跨界基因沉默菌株"中稳定存在,进一步利用Red/ET同源重组将该质粒整合进大肠杆菌的基因组中。实验结果表明,减毒、整合后的"跨界基因沉默菌株"能更好地发挥RNAi作用。该技术的完善将推进工程菌的研发和利用。

Red/ET重组及其在生物医学中的应用

通过应用Rac噬菌体的RecE RecT和λ噬菌体的RedαRedβ系统而建立的DNA工程平台———Red ET重组,是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、融合及突变等多种操作,在生物医学领域里具有广阔的应用前景,尤其在基因组功能研究中对BACs、PACs和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA靶分子的快速构建等方面最有效。随着Red ET重组的推广与应用,该技术本身也在不断被改进,在工作效率得到显著提高的同时,其操作也变得更加简单、省时、省力。结合自身的一些研究结果,对Red ET重组的技术特点、发展现状和在生物医学中的应用进行了详细阐述。

Red/ET系统研究进展及在微生物研究中的应用

传统的基因工程技术现已经不满足于后基因组时代的生命科学研究。新的同源重组系统-Red/ET系统具有所需同源臂短(35—60 bp),重组效率高等特点,通过诱导recE/recT或redα/redβ完成重组,可以采用各种策略对目标基因进行插入、敲除、点突变等一系列修饰操作,并且不需限制性内切酶和连接酶的作用。文章针对Red/ET系统的产生背景、原理、系统改进和应用作一阐述,并对Red/ET在微生物研究中的应用作了举例。

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.

红三七炮制工艺优化及其补血活性研究

目的优化红三七炮制工艺,并评价其补血活性。方法在单因素试验基础上,以蒸制温度、蒸制时间、烘干温度、烘干时间为影响因素,三七皂苷R1,人参皂苷Rg_(1)、Rb_(1)、Rk_(3)、Rh_(4),20(R)-人参皂苷Rg_(3)总含量为评价指标,Box-Behnken响应面法优化炮制工艺。建立乙酰苯肼(APH)-环磷酰胺(CTX)联合诱导的小鼠贫血模型,比较红三七、熟三七补血活性差异。结果最佳条件为蒸制温度130℃,蒸制时间4 h,烘干温度60℃,烘干时间48 h,总皂苷含量为8.326%,RSD为0.087%。药理活性表明,不同炮制工艺对三七补血活性有影响,红三七的补血活性优于熟三七。结论该方法稳定可行,可用于红三七的规范生产。

双组分因子LiaRS调控短短芽胞杆菌X23伊短菌素生物合成的研究

双组分系统(two-component system,TCS)参与多种芽胞杆菌次级代谢产物生物合成的调控,但调控伊短菌素生物合成的TCS鲜见报道。前期转录组测序分析发现,在短短芽胞杆菌X23中,双组分因子LiaRS与伊短菌素生物合成基因簇(edeBGC)的表达趋势一致,推测其可能参与伊短菌素生物合成的调控,通过Red/ET同源重组法敲除野生型X23的liaS和liaR基因,构建了突变体菌株,平皿对峙培养、qRT-PCR定量分析和HPLC-MS靶向代谢分析等结果表明,在相同培养条件下,突变菌株的抑菌圈直径较野生型显著增加,伊短菌素生物合成基因簇的表达量显著上调,且伊短菌素的峰面积是野生型的1.3倍。本研究发现LiaRS是伊短菌素生物合成的负调控因子,为伊短菌素的代谢工程改造提供了候选基因元件。

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒构建及应用

为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用Red/ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT053与HVT054位点处的95318~95319nt之间,获得了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组HVT(rHVT-H9-HA株),并对构建的毒株进行鉴定。结果显示,成功构建了含有HA基因的入门质粒pEntr-HA,通过Gateway克隆的LR反应将含有HA基因的表达盒转移到黏粒pFosC DEST的第53和54号基因之间形成pFosC HA;提取5个黏粒后,转染次代CEF细胞获得拯救重组病毒rHVT-H9-HA株。连续传代和动物试验结果表明,rHVT-H9-HA株毒价高,遗传稳定,可以克服母源抗体干扰,免疫持续期长,能够提供针对H9亚型禽流感的保护;同时也实现了一针防两病,效果明显优于灭活疫苗。本研究为H9亚型禽流感病毒重组HVT活载体疫苗的研制提供了技术支撑。

环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S.spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S.spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S.spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S.spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S.spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S.spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S.spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。

杨梅红色素的提取工艺研究

以新鲜杨梅为原料,以红色素的吸光度值为评价提取率的指标,在单因素实验的基础上,选用L9(34)进行正交实验,考察盐酸含量(%)、浸取温度、浸取时间、浸取物料比四因素对杨梅红色素提取工艺的影响。结果表明,杨梅红色素的较佳提取工艺条件为:盐酸浓度为0.30%,浸取温度为60℃,浸取时间为40min,浸取物料比为1:10。在此工艺条件下,杨梅红色素得率为13.7%。

Sterptomyces rochei 4089的L基因阻断变株的构建及功能研究

运用同源重组技术破坏了一株格尔德霉素产生菌Sterptomyces rochei 4089的L基因,该基因编码氧化还原酶。以Sterptomyces rochei 4089基因组总DNA为模板,PCR扩增AHBA-KLM基因簇,采取Red/ET重组技术,构建L基因阻断质粒pKC1139-KLM-KmR。采用大肠杆菌与链霉菌的结合转移将阻断质粒含AHBA-KLM基因簇和Kan表达单元的3.0 kb线性片段转化Sterptomyces rochei 4089菌株,在卡纳霉素的平板上筛选卡纳霉素抗性转化子,经PCR检测分离到L基因阻断突变菌株。对原、变株的发酵液进行TLC和HPLC分析显示,Sterptomyces rochei 4089基因组中的L基因失活后,导致该菌株不能合成安莎类抗生素格尔德霉素。通过阻断L基因,为筛查这类放线菌产生安莎类抗生素提供了明确的组分指示作用。

小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建

目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和BAC克隆,通过同源重组方式,获得套取质粒(p BR322-Shbg-Re);再分别以PL452及PL451为模板扩增出含Neo片段,经过再一轮的Red/ET重组成功实现条件性基因敲除打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)的构建。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的p BR322-MK-AB、p BR322-Shbg-Re、SHBG-Ln重组质粒和Shbg条件基因打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Shbg条件基因打靶载体,为后续Shbg基因条件敲除小鼠模型的构建奠定了基础。

应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略

目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5～2.0kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell)。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。

利用PCR产物快速构建免HPRT基因无启动子打靶载体

目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法，为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT）基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上，利用Red重组系统，从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上，产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒，通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt／Neo／Frt同源重组片段，最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定，表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。

转录调控因子AbrB对生防短短芽胞杆菌X23中抗生素edeines生物合成的影响

非核糖体类抗生素edeines是短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis X23产生的主要抑菌物质,提高其产量有助于增加生防效果。通过全基因组测序及生物信息学分析挖掘短短芽胞杆菌X23的全局性调控因子,基于Red/ET同源重组技术构建温敏型敲除载体,通过双交换同源重组技术获得短短芽胞杆菌X23全局性转录负调控因子缺失的突变株,然后采用平板抑菌、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)和实时荧光定量PCR研究了全局性转录负调控因子敲除对短短芽胞杆菌X23不同生长时期发酵液的抑菌活性、edeines产量、ede操纵子转录水平的影响。从短短芽胞杆菌X23基因组中挖掘到了1个全局性转录负调控因子AbrB,敲除abrB基因后edeines生物合成基因簇操纵子的转录水平在生长前期显著提高,在发酵48 h后abrB突变株中edeine A和edeine B总产量比出发菌株提高了1.1倍。结果显示短短芽胞杆菌X23中AbrB是edeines生物合成过程中的负调控因子,敲除abrB提高了edeines的产量。

美国红鱼酶解重组灌肠工艺研究

本实验介绍美国红鱼经过复合酶制剂酶解后,红鱼肉中的蛋白质及各种营养成分的价值都得到了提高,通过优化生产工艺条件,确定了红鱼肉重组加工生产的无衣灌肠的最佳加工工艺条件。