怀地黄85-5品种内遗传多样性的RAPD和ISSR分析

采用CTAB法提取了怀地黄85-5品种16个单株的基因组DNA,使用紫外分析和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和大小,利用RAPD及ISSR分析其品种内遗传多样性.从24个RAPD引物和43个ISSR引物中分别筛选出具有稳定多态性条带的RAPD引物3个和ISSR引物2个,分别对16个单株基因组DNA进行PCR扩增.3个RAPD引物共扩增出7条带,其中多态性条带为4个,多态性比率为57.14%.2个ISSR引物共扩增出17条带,其中多态性条带为11个,多态性比率为64.7%.结果表明,怀地黄85-5品种内存在遗传差异,但遗传多样性比地黄品种间的低.

怀地黄SRAP分子标记体系的建立与DNA指纹图谱的构建

以怀地黄DNA为模板,进行SRAP反应条件的优化及DNA指纹图谱构建,优化的反应体系为:25μL的体积中,模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.5 mmol.L-1,上下游引物各0.36μmol.L-1,dNTPs 0.30 mmol.L-1,Taq DNA酶2.0 U.构建了怀地黄23个品种的DNA指纹图谱,为怀地黄品种鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种和质量综合评价等研究奠定了基础.

培养基成分对怀地黄试管苗生长发育的影响

目的降低怀地黄试管苗的生产成本,为工厂化生产提供理论依据。方法比较1/2MS和MS、自来水和蒸馏水、白砂糖和蔗糖对怀地黄试管苗生长发育的影响。结果1/2MS培养基和MS培养基对怀地黄试管苗根数、鲜质量、干质量和叶绿素的量有极显著影响,对叶片数有显著影响,1/2MS培养基明显优于MS培养基。自来水和蒸馏水对试管苗根部、冠部、鲜质量增量、干质量和叶绿素的量均有显著性影响,试管苗在添加蒸馏水的培养基中的生长状况明显优于添加自来水。白砂糖和蔗糖对试管苗根部、冠部、鲜质量增量和干质量的影响不大,但对叶绿素的量有极显著影响,选用蔗糖作为碳源时,其叶片的叶绿素的量更高。结论1/2MS可以取代MS,白砂糖可以取代蔗糖。

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。

发根农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

利用发根农杆菌转化怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根在附加0.2mg/LKT和3.0mg/L6-BA的1/2MS培养基上能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛。rolB基因PCR和冠瘿碱纸电泳检测证明,农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达,获得转基因怀地黄。

怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析

目的对怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶(Rehmannia glutinosa f.hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase,RghKAT)cDNA全长基因进行克隆及分析,为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据。方法根据其他植物ARGOS基因序列的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,获得RghKAT cDNA全长序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对;利用实时荧光定量PCR技术检测了其在2个时期、10个组织的表达。结果 RghKAT基因全长1 713 bp,包含了1 395 bp的开放阅读框(ORF),编码464个氨基酸;同源比对和系统进化分析表明,RghKAT的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛果杨、拟南芥和小麦的KAT核苷酸序列同源性分别达84%、82%、82%、79%、73%;RghKAT编码的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的KAT氨基酸同源性分别为88%、88%、86%、87%、78%;各物种KAT酶进化树符合物种进化规律;理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质,蛋白质二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和β-转角构成;在N端存在一个由70个氨基酸残基组成的信号肽;RghKAT蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列;表达谱分析表明,RghKATmRNA在各时期、各组织中均有表达,盛花期花瓣中表达最强,而在幼苗期叶中表达量最低。结论成功克隆了RghKAT cDNA全长序列,具有KAT基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列,其在盛花期花瓣中表达量最高。