怀地黄85-5品种内遗传多样性的RAPD和ISSR分析

采用CTAB法提取了怀地黄85-5品种16个单株的基因组DNA,使用紫外分析和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和大小,利用RAPD及ISSR分析其品种内遗传多样性.从24个RAPD引物和43个ISSR引物中分别筛选出具有稳定多态性条带的RAPD引物3个和ISSR引物2个,分别对16个单株基因组DNA进行PCR扩增.3个RAPD引物共扩增出7条带,其中多态性条带为4个,多态性比率为57.14%.2个ISSR引物共扩增出17条带,其中多态性条带为11个,多态性比率为64.7%.结果表明,怀地黄85-5品种内存在遗传差异,但遗传多样性比地黄品种间的低.

怀地黄试管苗脱毒技术研究

对怀地黄试管苗的脱毒技术进行了研究.结果发现：以MS为基本培养基并附加适宜浓度细胞分裂素（6-BA0.5 mg·L^-1或KT0.5 mg·L^-1）时,茎尖成苗率最高（75%）,出愈率较低（20%）;切离的茎尖大小为0.2-0.5 mm时,既能保证较高的脱毒率又可保证较高的成苗率;两次切离茎尖并与热处理相结合,试管苗的脱毒率最高（96%-100%）,建立了一种有效的怀地黄脱毒方法和技术.

怀地黄块根的形态发生和结构发育

观察了怀地黄 Rehmannia glutinosa cv.H ueichingensis Hsiao. 块根的形态发生和生长发育过程中的形态结构变化 .采用怀地黄的传统栽培方法 ,即用上一年的块根作母根进行繁殖 ,分别从母根和不定芽的茎基部发生不定根 .怀地黄不定根的初生结构和维管形成层的发生与一般双子叶植物相同 ,但其次生生长却有两种方式 ,即正常次生生长和异常次生生长 .一类不定根的形成层产生的次生结构与一般双子叶植物相同 ,即次生木质部中主要是导管 ,而薄壁细胞较少 .这类不定根其次生生长为正常次生生长 normal secondary growth ,是担负吸收和固着作用的正常根 .另一种类型的不定根 ,其形成层产生的次生木质部含有大量的薄壁细胞 ,少量的导管分散在薄壁细胞之间 .这种次生生长为异常次生生长 anom alous secondary growth ,从而使不定根膨大 ,形成块根 .因此 ,怀地黄的药用部分在起源和结构上都属于根的性质 。

怀地黄SRAP分子标记体系的建立与DNA指纹图谱的构建

以怀地黄DNA为模板,进行SRAP反应条件的优化及DNA指纹图谱构建,优化的反应体系为:25μL的体积中,模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.5 mmol.L-1,上下游引物各0.36μmol.L-1,dNTPs 0.30 mmol.L-1,Taq DNA酶2.0 U.构建了怀地黄23个品种的DNA指纹图谱,为怀地黄品种鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种和质量综合评价等研究奠定了基础.

怀地黄补血作用的实验研究

通过生、熟怀地黄对小鼠失血性贫血的治疗及对骨髓造血细胞CFU-S、CFU-E培养的影响,了解到地黄可促进血虚动物RBC、Hb的恢复,加快CFU-S、CFU-E的增殖、分化,具显著的“生血”作用。

怀地黄6个主流品种产量相关性状及其相关分析

以6个怀地黄主流品种为材料,用测量法、观察法、称量法、紫外分光光度法和SPSS软件统计分析了单株鲜重产量和鲜重产量的相关性状及其相关性。结果表明,单株鲜重产量与叶绿素a含量、花序高度呈显著正相关,而与蒴果长度呈显著负相关,和花冠长度/宽度的比值呈极显著正相关。鲜重产量与块根长度/直径的比值呈显著负相关,而与块根直径、块根长度呈显著正相关。鲜重产量与蒴果长度之间有较强的负相关性。

不同怀地黄品种在地膜覆盖栽培下产量和品质的研究

以4个怀地黄主栽品种为材料,采用地膜覆盖密植栽培技术,用测量法、观察法、称量法、成分分析法,研究了4个品种单株产量和每公顷产量及其品质的差异.试验结果表明,地膜覆盖种植怀地黄后,4个怀地黄品种产量和品质都有差异,85-5产量最高,为95 038.95 kg.hm-2;北京1号梓醇最高,为0.14%;锌/铜北京3号最高,为110/1;还原糖含量生津最高,为6.742 7%;总糖含量北京1号最高,为98%.

PP333对怀地黄种质离体保存的影响

研究了PP333对怀地黄“85-5”脱毒苗离体保存的影响．结果表明：适宜浓度PP333（1-2mg·L^-1，单位下同）可以延缓脱毒苗的生长速度，延长其保存时间，减少其继代次数；高浓度PP333（4～8）对其生长产生毒害作用，不利于种质保存．适宜怀地黄脱毒苗离体保存的培养基为Ms＋NAA0．02＋6-BA0．2＋PP3331，在该培养基上保存180d后，存活率达68％，恢复培养时生长正常，成活率达100％．

不同产区地黄的比较研究

用石蜡切片法、薄切片法、高效液相色谱法对不同产区地黄块根的外部形态和内部解剖结构以及有效成分梓醇含量进行了比较研究,用SPSS 10.0软件系统分析了不同产区的主要生态因子与地黄块根中梓醇含量的相关性.结果表明,地黄道地药材怀地黄从外观上有以下特征:颜色较深,为黄褐色,形状为块状,最粗处直径大,长度/粗度比值小.而其解剖构造上的特征如下:横切面有菊花心,其他产区的地黄没有菊花心;怀地黄木质部/韧皮部的比值为3.7,木质部及木质部中薄壁细胞所占的比例都较其他产区要高.怀地黄中主要药用成分梓醇的含量也高于其他产区,通常都在9%以上.土壤类型与地黄块根中梓醇含量密切相关,怀地黄的道地产区土壤为砂壤土,是由黄河冲积而成的,这种土壤的特点是pH值为7.5～8.5、透气性好、持水保肥能力差.说明透气性好的弱碱性土壤适合地黄生长和梓醇积累.外地引种怀地黄块根有逐步退化变小的趋势,说明怀地黄之所以能成为'道地药材'与怀庆地区这个得天独厚的自然地理条件有密切关系.

航天搭载的怀地黄种子无菌萌发及试管苗快繁

为培育高产优质怀地黄新品种,本文对航天搭载的怀地黄种子的无菌萌发和试管苗的快繁技术进行了研究。结果表明:(1)0.05%HgCl2灭菌时间为5s时,种子的发芽率和发芽势最高,分别为68.33%和53.33%;(2)种子萌发的最适培养基为1/4MS,其发芽率和发芽势分别为76.67%和65.08%;(3)MS+6-BA1mg/L+NAA0.002mg/L为试管苗快繁的最适培养基,28d时试管苗株高增加7.85cm,繁殖系数达6.56。

响应面法优化酶法提取怀地黄梓醇的工艺

利用响应面分析法考察了酶用量、提取时间、pH值和提取温度4个因素对酶法提取怀地黄梓醇的影响。结果表明,酶法提取怀地黄梓醇的最佳工艺条件为:酶用量0.31%、提取时间147 min、pH值4.6、提取温度56℃,梓醇提取率达7.98%,与模型预测值基本相符。说明酶法可较好地应用于怀地黄梓醇的提取,通过响应面分析法能得到一个较好预测试验结果的模型方程。

怀地黄不同品种花粉形态的扫描电镜观察

利用扫描电镜观察了14个品种怀地黄[Rehmannia glutinosa f．hueichingens-is （Chan et Sehih）Hsiao]的花粉形态．结果表明：花粉均为单粒花粉，呈长圆形至长矩圆形，大小为40．2～46．9μm，具3个萌发孔，网状纹饰，网眼明显；根据花粉形状可将其分为3类：（1）长方形或近长方形（2）椭圆形或近椭圆形（3）梭形．研究表明，花粉特征，特别是花粉的形态特征，在怀地黄不同品种间具有的可见变异，它们在分类学上的价值应予以关注．

微波辅助提取怀地黄梓醇工艺研究

以微波处理为辅助手段,应用水浴法浸提怀地黄中梓醇.对利用微波技术提取怀地黄梓醇的工艺条件进行了研究,通过单因素和正交试验,考察了影响梓醇提取率的因素,微波辅助法提取梓醇的最佳工艺条件为:甲醇体积比50%,料液比1 g∶15 mL,在微波功率为400 W条件下处理时间为4 min,再在70℃水浴锅中保温浸提30 min,梓醇提取率在7.3%以上.

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。

怀地黄液泡质子泵焦磷酸水解酶基因的克隆与生物信息学分析

为了克隆地黄功能基因,根据NCBI GenBank核酸数据库中5种已知植物生长素诱导的器官膨大基因(ARGOS)碱基序列的保守区,利用CLUSTAL 2.1和DNAMAN 4.0软件设计简并引物,采用RT-PCR技术扩增出一个cDNA片段,测序表明,获得基因cDNA片段序列长度为495bp。经过NCBI数据库BLAST分析,发现它与莲花、蓖麻、烟草、苜蓿、葡萄、碧桃、灰绿藜7种植物的液泡膜质子泵焦磷酸水解酶基因同源性很高,在83%～86%,因此获得的基因是地黄液泡膜质子泵焦磷酸水解酶基因。

怀地黄脱毒试管苗生根移栽技术的研究

怀地黄为传统大宗中药材,为探究其脱毒试管苗生根移栽的最佳条件,提高移栽成活率,以怀地黄脱毒试管苗85-5为材料,探索了不同因子对地黄试管苗管内和管外生根的影响以及适宜于试管苗移栽的基质配比。结果表明:管内生根最适的PP333质量浓度为0.10mg/L,此时试管苗的根数达到28条,株高为4.0cm;接种密度为6个/瓶时,株高、叶片数、根数、根长都达到了较为理想的状态,根数达38条,株高为3.3cm;接种部位为顶芽时根数较多,达到38条,株高达到3.5cm,与侧芽相比有显著性差异;管外生根NAA生根效果明显优于IBA,2种激素最适浓度和处理时间分别为:NAA 50mg/L处理60min,苗存活率100%,生根率90%;IBA 50mg/L处理15min,苗的存活率95%,生根率85%;移栽基质的最适质量比例为草炭土∶蛭石=1∶2。

发根农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

利用发根农杆菌转化怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根在附加0.2mg/LKT和3.0mg/L6-BA的1/2MS培养基上能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛。rolB基因PCR和冠瘿碱纸电泳检测证明,农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达,获得转基因怀地黄。

培养基成分对怀地黄试管苗生长发育的影响

目的降低怀地黄试管苗的生产成本,为工厂化生产提供理论依据。方法比较1/2MS和MS、自来水和蒸馏水、白砂糖和蔗糖对怀地黄试管苗生长发育的影响。结果1/2MS培养基和MS培养基对怀地黄试管苗根数、鲜质量、干质量和叶绿素的量有极显著影响,对叶片数有显著影响,1/2MS培养基明显优于MS培养基。自来水和蒸馏水对试管苗根部、冠部、鲜质量增量、干质量和叶绿素的量均有显著性影响,试管苗在添加蒸馏水的培养基中的生长状况明显优于添加自来水。白砂糖和蔗糖对试管苗根部、冠部、鲜质量增量和干质量的影响不大,但对叶绿素的量有极显著影响,选用蔗糖作为碳源时,其叶片的叶绿素的量更高。结论1/2MS可以取代MS,白砂糖可以取代蔗糖。

怀地黄愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系的建立

研究了植物生长调节剂和接种方式对怀地黄叶片愈伤组织诱导的影响和细胞悬浮培养体系的建立。结果表明:将叶片正接在MS+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.4mg/L培养基上,愈伤组织生长良好,诱导率达100%;在该培养基上多次继代,可形成3种类型的愈伤组织,其中Ⅰ型愈伤组织淡黄色、颗粒透亮、分散性好且疏松易脆,适合进行细胞悬浮培养;在MS+2,4-D 3mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基中,悬浮培养细胞生长曲线呈"S"型,培养15d时细胞干重达最大值,为4.94g/L。

封口材料、蔗糖及谷氨酸对怀地黄试管苗生长发育的影响

为降低怀地黄(Rehmannia glutinosa f.hueichingensis)试管苗的生产成本,比较了封口膜与蘑菇袋、蔗糖培养与无糖培养、添加谷氨酸(Glu)培养与无Glu培养对怀地黄试管苗生长发育的影响。结果表明,蔗糖对试管苗的生长发育有极显著影响,蔗糖培养明显优于无糖培养;而封口材料与Glu仅对个别指标有显著影响,对怀地黄试管苗的整体生长发育情况无显著影响。所以,可以用蘑菇袋代替封口膜作为封口材料,但不能通过添加Glu用无糖培养代替有糖培养。