怀地黄试管苗脱毒技术研究

对怀地黄试管苗的脱毒技术进行了研究.结果发现：以MS为基本培养基并附加适宜浓度细胞分裂素（6-BA0.5 mg·L^-1或KT0.5 mg·L^-1）时,茎尖成苗率最高（75%）,出愈率较低（20%）;切离的茎尖大小为0.2-0.5 mm时,既能保证较高的脱毒率又可保证较高的成苗率;两次切离茎尖并与热处理相结合,试管苗的脱毒率最高（96%-100%）,建立了一种有效的怀地黄脱毒方法和技术.

怀地黄85-5品种内遗传多样性的RAPD和ISSR分析

采用CTAB法提取了怀地黄85-5品种16个单株的基因组DNA,使用紫外分析和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和大小,利用RAPD及ISSR分析其品种内遗传多样性.从24个RAPD引物和43个ISSR引物中分别筛选出具有稳定多态性条带的RAPD引物3个和ISSR引物2个,分别对16个单株基因组DNA进行PCR扩增.3个RAPD引物共扩增出7条带,其中多态性条带为4个,多态性比率为57.14%.2个ISSR引物共扩增出17条带,其中多态性条带为11个,多态性比率为64.7%.结果表明,怀地黄85-5品种内存在遗传差异,但遗传多样性比地黄品种间的低.

怀地黄SRAP分子标记体系的建立与DNA指纹图谱的构建

以怀地黄DNA为模板,进行SRAP反应条件的优化及DNA指纹图谱构建,优化的反应体系为:25μL的体积中,模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.5 mmol.L-1,上下游引物各0.36μmol.L-1,dNTPs 0.30 mmol.L-1,Taq DNA酶2.0 U.构建了怀地黄23个品种的DNA指纹图谱,为怀地黄品种鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种和质量综合评价等研究奠定了基础.

PP333对怀地黄种质离体保存的影响

研究了PP333对怀地黄“85-5”脱毒苗离体保存的影响．结果表明：适宜浓度PP333（1-2mg·L^-1，单位下同）可以延缓脱毒苗的生长速度，延长其保存时间，减少其继代次数；高浓度PP333（4～8）对其生长产生毒害作用，不利于种质保存．适宜怀地黄脱毒苗离体保存的培养基为Ms＋NAA0．02＋6-BA0．2＋PP3331，在该培养基上保存180d后，存活率达68％，恢复培养时生长正常，成活率达100％．

怀地黄脱毒试管苗培养条件的优化

研究了怀地黄脱毒试管苗在不同pH值、不同光照强度和不同温度下形态指标的差异,以寻求怀地黄脱毒试管苗的最适培养条件。结果表明：适合培养怀地黄脱毒试管苗的pH值在5.8~6.2,该pH值范围内,试管苗生长较健壮,株高和繁殖系数最大,分别为6.66 cm和4.8。最适合培养怀地黄脱毒试管苗的光照强度为2 500 lx,此光照强度下,试管苗生长较健壮,叶色浓绿,株高和繁殖系数分别为5.2 cm和4.6。最适合培养怀地黄脱毒试管苗的环境温度值为30℃,该温度下试管苗生长较健壮,株高和繁殖系数最高,分别为5.8 cm和4.8。因此,适合怀地黄脱毒试管苗生长的pH值为5.8~6.2、光照强度为2 500 lx、温度为30℃。

航天搭载的怀地黄种子无菌萌发及试管苗快繁

为培育高产优质怀地黄新品种,本文对航天搭载的怀地黄种子的无菌萌发和试管苗的快繁技术进行了研究。结果表明:(1)0.05%HgCl2灭菌时间为5s时,种子的发芽率和发芽势最高,分别为68.33%和53.33%;(2)种子萌发的最适培养基为1/4MS,其发芽率和发芽势分别为76.67%和65.08%;(3)MS+6-BA1mg/L+NAA0.002mg/L为试管苗快繁的最适培养基,28d时试管苗株高增加7.85cm,繁殖系数达6.56。

怀地黄基因片段及其中转座酶基因的克隆与序列分析

根据已知裂叶牵牛花PNZIP启动子碱基序列的相关信息设计引物,采用PCR方法,从怀地黄基因组中扩增出5个基因片段,回收和克隆出其中一个1 096bp的基因片段。经过NCBI对比分析,发现它是一个类似转座子的相关蛋白基因序列,含有一个完整的开放阅读框,大小为450bp,编码由150个氨基酸组成的转座酶。然后,基于该开放阅读框的碱基序列,设计另一对引物,用PCR方法,从中扩增出该完整开放阅读框的序列片段。

多效唑与膨大素组合对脱毒怀地黄生长发育和品质的影响

【目的】探讨多效唑(PP333)与膨大素(CPPU)组合对怀地黄产量和品质的影响,为脱毒怀地黄高产优质生产提供实践参考。【方法】在85-5怀地黄脱毒苗块茎膨大期用PP333200.0 mg/L和CPPU 0、0.667、1.333和2.000 mg/L喷施怀地黄脱毒苗,调查怀地黄脱毒苗的株高、冠幅、功能叶面积和叶片数等形态指标,收获后测定其产量和品质。【结果】PP333浓度为200.0 mg/L时,怀地黄脱毒苗的株高、叶面积和冠幅随CPPU喷施浓度和次数的增加呈逐渐下降趋势,产量随CPPU喷施浓度的增加呈先上升后下降趋势,其中CPPU 1.333 mg/L处理产量最高,为80520.00 kg/ha;怀地黄块茎的梓醇含量和毛蕊花糖苷含量随CPPU浓度增加呈逐渐增高趋势,在CPPU浓度2.000 mg/L时分别达17.23和0.93 mg/g。CPPU浓度为1.333 mg/L时,喷施1次和两次的怀地黄产量较高,喷施3次的产量较低;喷施两次1.333 mg/L CPPU的怀地黄块茎梓醇含量和毛蕊花糖苷含量最高,分别为17.15和1.35 mg/g。【结论】PP333和CPPU组合处理脱毒怀地黄能有效提高其产量,改善其品质,提高其药用价值;在怀地黄高产优质栽培中,推荐喷施两次PP333200.0 mg/L和CPPU 1.333 mg/L组合。

怀地黄液泡质子泵焦磷酸水解酶基因的克隆与生物信息学分析

为了克隆地黄功能基因,根据NCBI GenBank核酸数据库中5种已知植物生长素诱导的器官膨大基因(ARGOS)碱基序列的保守区,利用CLUSTAL 2.1和DNAMAN 4.0软件设计简并引物,采用RT-PCR技术扩增出一个cDNA片段,测序表明,获得基因cDNA片段序列长度为495bp。经过NCBI数据库BLAST分析,发现它与莲花、蓖麻、烟草、苜蓿、葡萄、碧桃、灰绿藜7种植物的液泡膜质子泵焦磷酸水解酶基因同源性很高,在83%～86%,因此获得的基因是地黄液泡膜质子泵焦磷酸水解酶基因。

怀地黄不同品种花粉形态的扫描电镜观察

利用扫描电镜观察了14个品种怀地黄[Rehmannia glutinosa f．hueichingens-is （Chan et Sehih）Hsiao]的花粉形态．结果表明：花粉均为单粒花粉，呈长圆形至长矩圆形，大小为40．2～46．9μm，具3个萌发孔，网状纹饰，网眼明显；根据花粉形状可将其分为3类：（1）长方形或近长方形（2）椭圆形或近椭圆形（3）梭形．研究表明，花粉特征，特别是花粉的形态特征，在怀地黄不同品种间具有的可见变异，它们在分类学上的价值应予以关注．

肥力水平对脱毒怀地黄农艺性状和产量及品质的影响

以怀地黄脱毒苗为试材,研究了追施不同浓度的鲁西复合肥对脱毒怀地黄的农艺性状和产量及品质的影响。结果表明:在怀地黄各个生长时期,随着肥力水平的增加,其株高、冠幅、叶片数和叶面积呈现先增高后降低的变化规律,鲁西复合肥肥力水平在75kg/667m2时株高和叶片数呈最大值,肥力水平在112.5kg/667m2时冠幅和功能叶面积达到最大值;产量和品质随着施肥量的增加呈现先增高后降低的趋势,追加鲁西复合肥75kg/667m2为较适宜的肥力水平,此时怀地黄的产量达到5 683kg/667m2,梓醇和毛蕊花糖苷含量分别达到21.27和0.35mg/g。

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。

怀地黄脱毒试管苗生根移栽技术的研究

怀地黄为传统大宗中药材,为探究其脱毒试管苗生根移栽的最佳条件,提高移栽成活率,以怀地黄脱毒试管苗85-5为材料,探索了不同因子对地黄试管苗管内和管外生根的影响以及适宜于试管苗移栽的基质配比。结果表明:管内生根最适的PP333质量浓度为0.10mg/L,此时试管苗的根数达到28条,株高为4.0cm;接种密度为6个/瓶时,株高、叶片数、根数、根长都达到了较为理想的状态,根数达38条,株高为3.3cm;接种部位为顶芽时根数较多,达到38条,株高达到3.5cm,与侧芽相比有显著性差异;管外生根NAA生根效果明显优于IBA,2种激素最适浓度和处理时间分别为:NAA 50mg/L处理60min,苗存活率100%,生根率90%;IBA 50mg/L处理15min,苗的存活率95%,生根率85%;移栽基质的最适质量比例为草炭土∶蛭石=1∶2。

肥力水平对怀地黄脱毒苗生长发育和生理特性的影响

研究了不同肥力水平对怀地黄脱毒苗生长发育和生理特性的影响。结果表明:随着肥力水平的增加,怀地黄脱毒苗的株高、冠幅、功能叶面积和叶片数呈先升高后降低的变化趋势,但变化较小,差异大多未达到显著水平。8月份,氮磷钾复合肥1 125kg/hm2处理的株高和叶片数最大(35.29cm、26.62片);1 687.5kg/hm2处理的功能叶面积最大(410.32cm2);9月份,1 687.5kg/hm2处理的冠幅最大(60.52cm)。叶绿素总含量、净光合速率和蒸腾速率均随着肥力水平的增加呈先上升后下降的趋势,1 687.5kg/hm2处理达到最大值,分别为2.39mg/g、26.30μmol/(m2.s)、6.55mmol/(m2.s);叶片的过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性随着肥力水平的增加而增加。综合考虑,氮磷钾复合肥1 687.5kg/hm2较适宜脱毒怀地黄苗的生长发育。

发根农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

利用发根农杆菌转化怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根在附加0.2mg/LKT和3.0mg/L6-BA的1/2MS培养基上能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛。rolB基因PCR和冠瘿碱纸电泳检测证明,农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达,获得转基因怀地黄。

怀地黄愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系的建立

研究了植物生长调节剂和接种方式对怀地黄叶片愈伤组织诱导的影响和细胞悬浮培养体系的建立。结果表明:将叶片正接在MS+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.4mg/L培养基上,愈伤组织生长良好,诱导率达100%;在该培养基上多次继代,可形成3种类型的愈伤组织,其中Ⅰ型愈伤组织淡黄色、颗粒透亮、分散性好且疏松易脆,适合进行细胞悬浮培养;在MS+2,4-D 3mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基中,悬浮培养细胞生长曲线呈"S"型,培养15d时细胞干重达最大值,为4.94g/L。

怀地黄试管苗的快繁体系研究

[目的]建立怀地黄试管苗的快繁体系。[方法]分别进行了NAA、6-BA和KT对茎尖培养以及NAA、6-BA试管苗快速繁殖的试验。[结果]中低浓度的NAA和6-BA可以在一定程度上促进怀地黄试管苗的快速繁殖,而高浓度的NAA和6-BA则会抑制怀地黄试管苗的快速繁殖;优选出的怀地黄试管苗的快速繁殖的最佳培养基为MS+0.002 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA。[结论]试验优选出了怀地黄试管苗的快速繁殖的最佳培养基,为怀地黄的开发利用提供了理论依据。

怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析

目的对怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶(Rehmannia glutinosa f.hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase,RghKAT)cDNA全长基因进行克隆及分析,为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据。方法根据其他植物ARGOS基因序列的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,获得RghKAT cDNA全长序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对;利用实时荧光定量PCR技术检测了其在2个时期、10个组织的表达。结果 RghKAT基因全长1 713 bp,包含了1 395 bp的开放阅读框(ORF),编码464个氨基酸;同源比对和系统进化分析表明,RghKAT的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛果杨、拟南芥和小麦的KAT核苷酸序列同源性分别达84%、82%、82%、79%、73%;RghKAT编码的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的KAT氨基酸同源性分别为88%、88%、86%、87%、78%;各物种KAT酶进化树符合物种进化规律;理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质,蛋白质二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和β-转角构成;在N端存在一个由70个氨基酸残基组成的信号肽;RghKAT蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列;表达谱分析表明,RghKATmRNA在各时期、各组织中均有表达,盛花期花瓣中表达最强,而在幼苗期叶中表达量最低。结论成功克隆了RghKAT cDNA全长序列,具有KAT基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列,其在盛花期花瓣中表达量最高。

多效唑对脱毒怀地黄光合生理和抗性生理的影响

以脱毒怀地黄为试材,对多效唑不同喷施浓度处理下脱毒怀地黄叶片光合色素含量、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、相对电导率(REC)等的变化进行了研究。结果表明:多效唑不同喷施浓度处理的脱毒怀地黄叶片光合色素含量,SOD、POD、CAT活性均高于对照,而REC均低于对照;脱毒怀地黄叶片光合色素含量,SOD、POD、CAT活性均随多效唑浓度的增加而逐渐提高,浓度为200mg/L时效果最好;REC随多效唑处理浓度的增加逐渐减小。

多效唑对脱毒怀地黄生长发育、产量及品质的影响

以继代培养的怀地黄脱毒试管苗"85-5"为试材,研究了多效唑不同喷施浓度和处理次数对脱毒怀地黄生长发育、产量和品质的变化规律。结果表明:随着多效唑喷施浓度和处理次数的增加,怀地黄脱毒苗的株高、叶面积和冠幅都呈现逐渐下降的趋势;随着多效唑喷施浓度和次数的增加,怀地黄产量和品质呈现先上升后下降的趋势;多效唑200mg/L处理2次是最佳喷施浓度和喷施次数,此时脱毒怀地黄产量最高,为5 682.67kg/667m2;梓醇和毛蕊花糖苷含量较大,分别为8.33mg/g和0.55mg/g。