重组人血管内皮抑制素联合TP方案治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察

目的观察YH-16联合紫杉醇和顺铂(TP)治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的近期疗效和安全性,同时探讨循环血管内皮细胞(CECs)与该方案疗效的相关性。方法比较观察组和对照组治疗晚期NSCLC的近期疗效及毒副反应,采用流式细胞学法检测治疗前后外周血CECs数量。结果观察组和对照组有效率(CR+PR)分别为62.50%和22.22%(P=0.035);临床受益率分别为87.50%和50.00%(P=0.030);两组Ⅲ～Ⅳ级白细胞减少发生率分别为31.25%和33.33%;Ⅲ～Ⅳ级血小板减少发生率分别为25.00%和27.78%;恶心、呕吐发生率分别为56.24%和50.00%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 YH-16联合TP疗效优于单独应用TP,不增加毒副反应,CECs可能是一个较好的预测化疗联合抗血管生成治疗疗效的标志。

携载VEGF基因的聚四氟乙烯血管材料对内皮细胞生长的促进作用

目的：研究聚四氟乙烯（PTFE）血管材料携载血管内皮生长因子（VEGF）基因并促进内皮细胞生长的可行性．方法：将pCDI-hVEGF121／pCDI质粒溶液处理过的PTFE人工血管修剪成圆片，置于生理盐水中并于0．5，1，2，4，8，16，24，48和72h测定溶液的吸光度，计算出溶液的DNA浓度，绘出体外释放曲线．分离和培养人脐静脉内皮细胞，将内皮细胞种植到携带基因质粒的PTFE材料表面，在6，24，72和120h检测细胞增殖情况并用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的表达量．结果：体外释放曲线提示在0．5～4h的这段时间内，质粒释放较快，随后进入缓慢增长期，直至72h仍有质粒的释放．在24，72和120h时间点，VEGF质粒组PTFE材料上的内皮细胞数和增长倍率都明显高于空质粒组材料（P〈0．05），在6，24，72和120h时间点，VEGF质粒组培养液的VEGF蛋白水平和增长倍率也明显高于空质粒组（P〈0．01）．结论：证实了PTFE材料携带VEGF基因转染内皮细胞并具有促进其生长的可能性．

完整视网膜毛细血管网消化铺片技术及细胞计数方法的改进

背景 以往视网膜血管消化铺片法仅能够获得部分视网膜血管,无法客观评价全视网膜血管的病理改变,因此进一步获得完整的视网膜血管网是相关疾病实验研究和临床研究的基础. 目的 在国外对全视网膜血管消化铺片技术的基础上进行改良,建立全视网膜血管的铺片方法. 方法 30只健康Wistar 大鼠随机数字表法分为模型组和对照组,模型组20只大鼠用溶于0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液的质量分数1.25％链脲佐菌素（STZ）腹腔内注射法制作糖尿病模型,对照组10只大鼠以同样的方法注射等容量柠檬酸缓冲液.注射后8个月经左心室注射PBS 100 ml,剪开右心房使血液及PBS流出后注射质量分数4％多聚甲醛100 ml,摘除眼球,将完整剥离的大鼠视网膜先进行胰蛋白酶消化,然后剥离玻璃体及内界膜,去除视网膜神经组织,得到完整的视网膜毛细血管网,平铺于载玻片上,将视网膜毛细血管网以视盘为中心划为内、中、外3个区域,采用盲法在光学显微镜下判定和计数中间区域影周细胞及无细胞血管. 结果 视网膜铺片显示,大鼠的视网膜血管为全血管型,可见放射状的视网膜中央动脉与视网膜中央静脉主干及逐级分支结构、小动脉与小静脉之间表浅层和深层的毛细血管网.周细胞略突出于血管管壁,在其形成影周细胞时,原有的细胞核缺失.无细胞血管的管径为邻近毛细血管管径的20％以上,并且在整个血管上无细胞核和影周细胞.结论 全视网膜消化铺片技术能够提供实验所需的完整视网膜毛细血管网,配合细胞计数方法,能够较好地评价视网膜的形态改变,并为视网膜血管和管壁细胞的定量分析提供有利条件.

血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成

目的 观察血管钠肽 (Vasonatrin peptide,VNP)对低氧状态下大鼠心肌成纤维细胞 (CFs)增殖及胶原合成的影响 ,探讨其防治低氧所致心肌间质结构重建的作用机制 .方法 培养新生大鼠 CFs,应用流式细胞仪分析细胞周期 ,以 3H- proline掺入率反映胶原合成速率 .结果 单纯低氧不改变 CFs的细胞周期 ,但增加低浓度血清 (2 5 m L· L- 1 )作用基础上的细胞增殖指数 PI(S+G2 / M) / (S+G2 / M+G0 / G1 )(P<0 .0 1) ,10 - 6 m ol· L- 1的 VNP抑制低氧诱导的 PI增加(P<0 .0 1) .低氧可以增加基础胶原合成 (增加 19.6 % ,P<0 .0 5 ) ,也增加低浓度血清 (2 5 m L· L- 1 )诱导的胶原合成速率 (增加 37.2 % ,P<0 .0 1) . 10 - 8～ 10 - 6 mol· L- 1 的 VNP浓度依赖性抑制低氧诱导的胶原合成速率 (P<0 .0 1) .结论 低氧增加胶原合成以及血清刺激的 CFs的增殖反应 ,VNP抑制上述作用 。

细胞外液酸碱度对主动脉平滑肌细胞电生理的影响

目的 :探讨细胞外液酸碱度 ( p H0 )的改变对主动脉平滑肌细胞电生理特性的影响。方法 :通过改变培养的乳鼠主动脉平滑肌细胞外液的酸碱度 ,应用全细胞膜片钳技术记录细胞膜的变化和钾离子通道活动的情况。结果 :p H0 降低时引起细胞膜超极化 ,外向钾电流增大 ;反之 ,p H0升高时引起细胞膜去极化 ,外向钾电流减小。这种变化可以被 TEA阻断 ,而对 4- AP不敏感。结论 :p H0 改变引起主动脉平滑肌细胞膜电位及外向电流幅值变化 。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1／VEGF信号通路的抑制作用

背景视网膜新生血管（RNV）是多种眼底血管疾病的共同表现，研究证实胰岛素样生长因子（IGF-1）能够刺激血管内皮细胞的增生，从而促进新生血管的形成，而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用。但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚。目的研究PSF对IGF-1／血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的调控作用。方法将猕猴视网膜血管内皮细胞RF／6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil．PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组，分别在细胞中转人真核质粒Pegfp—C2-PSF、pGenesil—PSF—RNAi及相应的空白质粒。各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1（IGF-1）以刺激细胞生长，采用MTT法检测各组RF／6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量，用于进一步的实验。采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF／6A细胞中VEGFmRNA的表达；采用Westernblot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶（ERK）活化的促进作用。结果IGF-1刺激后Pegfp．C2．PSF质粒转染组以0．50IxgPSF为最适剂量，其RF／6A细胞的增生率为0．220±0．020，细胞中VEGFmRNA相对表达量为0．79±0．07，分别低于其对照组的0．260±0．006和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．040、0．016）；IGF-1刺激后pGenesil—PSF—RNAi质粒转染组以1．00IxgPSF作为最适剂量，其RF／6A细胞增生率为0．35±0．02，VEGFmRNA相对表达量为2．29＋0．43，分别高于其对照组的0．210-4-0．019和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．003、0．019）。IGF-1刺激后1、3、6hPegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组，差异均有统计学意义（P=0．017、0．000、0．000）。Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126’处理后细胞中VEGFmRNA的相对表达量为0．93±0．21，明显低于未转染组的1．32±0．08，差异均有统计学意义（P=0．037），同时明显低于Pegfp—C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGFmRNA的相对表达量1．23±0．09，差异有统计学意义（P=0．002）。结论PSF可抑制IGF-1诱导的RF／6A细胞中的ERK信号通路的活化，下调VEGF在RF／6A细胞中的表达，进而抑制RF／6A细胞的增生。

转甲状腺素蛋白对视网膜微血管内皮细胞生物学行为的影响

目的：观察转甲状腺素蛋白（TTR）对视网膜微血管内皮细胞（RMVEC）生物学行为的影响。方法培养的 RMVEC 依照 TTR 浓度不同分为0（初始浓度）、4μmol/L 组。培养48 h 后,噻唑蓝（MTT）比色法、细胞迁移实验分别检测不同浓度 TTR 对 RMVEC 增生、迁移的影响。细胞划痕实验检测培养0（初始时间）、24、48 h 时细胞损伤愈合情况。结果MMT 比色法检测结果显示,初始浓度组、4μmol/L 组吸光度[A,旧称光密度（OD）]值分别为0.17±0.02、0.40±0.03。两组 A 值比较,差异有统计学意义（t =15.47,P =0.0001）。细胞迁移实验结果显示,初始浓度组、4μmol/L 组 RMVEC 向外迁移数分别为（140±7）、（227±14）个。两组间 RMVEC 向外迁移数比较,差异有统计学意义（t=5.44,P =0.0006）。细胞划痕实验结果显示,初始时间各组细胞划痕距离大致相等；24 h,初始浓度组、4μmol/L 组细胞划痕愈合距离分别为（134.4±45.4）、（330.0±23.1）μm。两组细胞划痕愈合距离比较,差异有统计学意义（t =8.25,P 〈0.01）。48 h,4μmol/L 组完全愈合,初始浓度组未愈合。结论TTR 对 RMVEC 增生、迁移和损伤愈合有明显促进作用。

精氨酸酶抑制剂对体外高糖培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞的保护作用

目的 观察精氨酸酶（Arg）抑制剂N羟基-正-Ｌ精氨酸（nor-NOHA）对体外高糖培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞（RF/6A细胞）的保护作用。 方法 体外培养RF/6A细胞，并将其分为正常对照组（A组）、高糖对照组（B组）、高糖＋nor-NOHA处理组（C组）、高糖＋二甲基亚砜（DMSO）对照组（D组）。A组细胞以5.5 mmol/L葡萄糖继续培养；B～D组以25.0 mmol/L葡萄糖继续培养，C、D组分别加入125 mg/L的nor-NOHA及1%DMSO。采用噻唑蓝比色法、Transwell小室法和体外成管实验分别检测各组RF/6A细胞增生、迁移和管腔形成能力。采用荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组RF/6A细胞中ArgⅠ、内皮型一氧化氮（NO）合酶（eNOS）、诱导型NO合酶（iNOS）的mRNA相对表达量。采用酶链免疫吸附测定试验（ELISA）检测各组RF/6A细胞培养上清液中NO和白细胞介素（IL）-1b的分泌量。 结果 B组RF/6A细胞增生、凋亡及管腔形成能力较A组明显降低，差异有统计学意义（t=2.367、5.633、7.045，P＜0.05）；C组RF/6A细胞增生、凋亡及管腔形成能力较B组提高，差异有统计学意义（t=5.260、6.952、8.875，P＜0.05）。RT-PCR检测结果显示，与A组比较，B组RF/6A细胞中ArgⅠ、iNOS mRNA相对表达量升高（t=6.836、3.342），C组RF/6A细胞中ArgⅠ、iNOS mRNA相对表达量降低（t=4.904、7.192），差异均有统计学意义（P＜0.05）；B组RF/6A细胞中eNOS mRNA相对表达量降低（t=4.165），C组RF/6A细胞中eNOS mRNA相对表达量升高（t=6.594），差异均有统计学意义（P＜0.05）。ELISA检测结果显示，与A组比较，B组RF/6A细胞培养上清液中NO分泌量减少（t=4.925），C组RF/6A细胞培养上清液中NO分泌量增多（t=5.368），差异均有统计学意义（P＜0.05）；B组RF/6A细胞培养上清液中IL-1b分泌量增多（t=5.032），C组RF/6A细胞培养上清液中IL-1b分泌量减少（t=7.792），差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 nor-NOHA对体外高糖培养的RF/6A细胞有保护作用，可提高其增生、迁移及管腔形成能力；其机制可能是通过平衡Arg/NOS的表达从而抑制氧化应激反应。

高糖状态下视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析

目的观察高糖状态下视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析结果。方法体外培养视网膜血管内皮细胞，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为对照组、高糖组，两组细胞分别采用5、25 mmol/L的葡萄糖持续培养48 h。应用RNA-Seq技术对两组细胞进行全转录组测序，获得生物学大数据，并在此基础上分析差异表达基因；通过GO功能、Pathway显著性富集分析对差异基因的功能及所在的信号通路进行解释说明。结果对照组和高糖组之间共有449个差异表达基因。其中，上调基因297个，下调基因152个。差异基因功能涉及分子生物学过程调控以及细胞的能量代谢、蛋白合成等诸多方面，其中ITGB1BP2、NCF1、UNC5C等与炎症的产生相关；AKR1C4、ATP1A3、CHST5、LCTL等与细胞的能量代谢相关；DAB1、PRSS55等与蛋白合成相关；SMAD9、BMP4等与细胞外基质的代谢相关。GO功能显著性富集分析结果显示，差异基因的功能主要可以划分为生物学行为调控，细胞组分形成以及分子功能三大板块，主要集中表现在生物学过程部分的系统形成和调节多细胞有机体的形成等。Pathway显著性富集分析前20条具有明显差异的通路，发现差异表达比较明显的是转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、补体通路等，色氨酸、丝氨酸、氰氨酸等与氨基酸代谢相关的通路也受到了影响。其中，白细胞抑制因子9、骨形成蛋白4通过TGF-β信号通路发挥作用。结论高糖通过破坏视网膜血管内皮细胞的跨膜传导、细胞外基质代谢以及蛋白质的转录和翻译等，从而影响视网膜血管内皮细胞的功能。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。

抗血管内皮生长因子药物治疗后视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA—Seq分析

目的 观察抗血管内皮生长因子（VEGF）药物治疗后视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析结果.方法 体外培养视网膜血管内皮细胞,取对数生长期细胞用于实验.将细胞分为VEGF组、VEGF联合抗VEGF药物组.VEGF组细胞采用50 ng/ml VEGF持续作用72 h,以模拟糖尿病视网膜病变中血管内皮细胞的高VEGF生存环境.VEGF联合抗VEGF药物组细胞采用50 ng/ml VEGF＋2.5 μg/ml抗VEGF药物持续作用72 h,以仿效抗VEGF药物治疗后细胞所处的微环境.应用RNA-Seq技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,并在此基础上分析差异表达基因;通过GO功能、Pathway显著性富集分析对差异基因的功能及所在的信号通路进行解释说明.结果 分别获得两组细胞的基因表达谱信息.两组细胞之间共存在328个差异表达基因,包括194个上调基因和133个下调基因.差异基因功能涉及分子生物学过程调控以及细胞的能量代谢、蛋白合成等诸多方面,其中SI、PRX、HPGD与蛋白合成相关,BIRC7与细胞凋亡相关,而ABLIM1、CRB2与视网膜发育相关,ABCG1、ABCA9、ABCA12与巨噬细胞胆固醇和磷脂转运相关.GO功能显著性富集分析结果显示,差异基因的功能主要可以划分为生物学行为调控、细胞组分形成以及分子功能三大板块.Pathway显著性富集分析结果显示,Notch信号通路、细胞外基质受体通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、Wnt信号通路表达在两组细胞间存在差异,而其中又以与纤维化进程调控密切相关的TGF-β信号通路中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ（CAMK2B）、胶原蛋白Ⅲ型α1链（COL3A1）、细胞球蛋白（CYGB）、前列腺素E受体2（PTGER2）、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2等基因的差异表达最为引人关注.结论 抗VEGF药物治疗后可能导致CAMK2B、COL3A1、CYGB、PTGER2等TGF-β通路相关基因的表达上调进而加剧视网膜纤维化进程.

结缔组织生长因子重组干扰载体慢病毒颗粒的构建及其对视网膜血管内皮细胞内源性结缔组织生长因子表达的抑制作用

目的构建结缔组织生长因子（CTGF）重组干扰载体（shRNA），观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。 方法构建人源CTGF shRNA，应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞，利用干扰载体中的红色荧光标记示踪并筛选慢病毒的最佳感染复数及起效时间。将细胞分为空白对照组（正常培养）、感染对照组（Scramble shRNA病毒感染）及CTGF敲低组（CTGF shRNA病毒感染）。通过Transwell细胞迁移实验观察3组细胞的迁移能力；实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测3组细胞的结缔组织生长因子（CTGF）、纤连蛋白（FN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）的mRNA和蛋白表达。3组间数据比较采用方差分析。 结果CTGF shRNA的最佳感染复数为20，最佳起效时间是72 h。Transwell细胞迁移实验结果显示，CTGF敲低组穿过小孔细胞数较空白对照组及感染对照组明显降低，差异均有统计学意义（F=20.64，P=0.002）。实时定量PCR及Western blot检测结果显示，CTGF敲低组CTGF、FN、α-SMA、ColⅠ mRNA（F=128.83、124.44、144.76、1 374.44，P=0.000、0.000、0.000、0.000）和蛋白表达（F=22.55、41.60、25.73、161.68，P=0.002、0.000、0.001、0.000）较空白对照组、感染对照组明显降低，差异均有统计学意义。 结论成功构建的CTGF shRNA慢病毒颗粒可有效抑制视网膜血管内皮细胞迁移并下调内源性CTGF的表达。

高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白对视网膜血管内皮细胞的影响

目的观察高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白（TTR）对人视网膜血管内皮细胞（hREC）的影响。方法分别于5．5mmol／L葡萄糖（低糖，LG）、25．0mmol／L葡萄糖（高糖，HG）以及200μmol／LCoCl2诱导的缺氧环境中培养hREC、人视网膜色素上皮细胞（hRPEC），并据此分为LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组。实时无标记细胞功能分析仪检测细胞培养初始时间（Oh）及培养后4、8、16、24、36、48、60、72h的细胞生长指数。分别在LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组细胞培养基中添加4tLmol／LTTR，即LG组＋TTR、LG缺氧组＋TTR、HG组＋TTR、HG缺氧组＋TTR，观察TTR对hREC和hRPEC的作用以及hRPEC对hREc生长的影响。Transwell共培养体系观察hPEPC对hREC生长影响。结果培养后72h，LG组hREc、hRPEC生长指数明显高于LG缺氧组、HG组，差异均有统计学意义（hREC：F=17．098、22．970，P〈0．05；hRPEC：F=45．442、9．011，P〈0．05）；HG组、HG缺氧组hREC、hRPEC生长指数显著降低，差异均有统计学意义（hREC：F=146．184，P〈0．05；hRPEC：F=27．907，P〈0．05）。HG组＋TTR、HG缺氧组＋TTRhREC生长指数显著低于HG组、HG缺氧组，两组hREC生长指数比较，差异有统计学意义（F=161．430、24．106，P〈0．05）；LG组＋TTR、LG缺氧组＋TTRhREC生长指数高于LG组，LG缺氧组，两组hREC生长指数比较，差异有统计学意义（F=200．486、48．662，P〈0．05）。LG组＋TTR、LG缺氧组＋TTR、HG组＋TTR、HG缺氧组＋TTRhRPEC生长指数均较LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组略高，但差异无统计学意义（P〉0．05）。共培养与单独生长细胞相比，共培养hRPEC对hREC生长有显著抑制作用，差异有统计学意义（LG组：F=15．711，P〈0．05；LG缺氧组：F=45．659，P〈0．05；HG组：F=7．857，P〈0．05；HG缺氧组：F=6．348，P〈0．05）。绪论高糖缺氧环境下TTR对hREC生长有抑制作用。

聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子高表达对糖基化终末产物诱导下人视网膜微血管内皮细胞氧化损伤的作用

目的观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下人视网微血管内皮细胞(hRMECs)氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉(ZnPP)组及PSF+ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基,置于37°C、95%空气、5%CO2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP(10 mol/L)处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后,再用ZnPP(10 mol/L)预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激,HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)、磷酸化(p)细胞外调节蛋白激酶(ERK)、核因子2相关因子2(Nrf2)的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126,Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。结果HE染色和Hoechst33258染色结果显示,PSF组受损细胞核数较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异均有统计学意义(F=27.5、38.7,P<0.05)。流式细胞法结果显示,PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异有统计学意义(F=126.4,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加,差异均有统计学意义(F=70.1,P<0.05);AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较,差异均有统计学意义(F=474.0,P<0.05);PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加,PSF+/U0126+组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低,差异有统计学意义(F=30.2、489.4,P<0.05)。结论PSF高表达可以通过活化ERK通路,促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达,从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。

高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白对人视网膜血管内皮细胞生长抑制作用机制

目的探讨高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白（TTR）对人视网膜血管内皮细胞（hREC）生长抑制作用的机制。方法将hREC分为正常组、高糖组、正常缺氧组、高糖缺氧组、正常＋TTR组、高糖＋TTR组、正常缺氧＋TTR组及高糖缺氧＋TTR组，各组细胞均置于Dulbecco改良Eagle培养基中培养。正常组、正常缺氧组培养基中加入5．5mmol／L葡萄糖；高糖组、高糖缺氧组培养基中加入25．0mmol／L葡萄糖；正常缺氧组、高糖缺氧组培养基中加入200btmol／L氯化钴；正常＋TTR组、高糖＋TTR组、正常缺氧＋TT1潍及高糖缺氧＋TT嘲除高糖及缺氧诱导外，于细胞贴壁后再加入4p．mol／LTTR。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测各组细胞磷酸激酶B（Akt）、磷酸化Akt（P．Akt）、B细胞淋巴瘤／8血病．2（Bcl-2）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）及Bcl-2相关X蛋白（Bax）的蛋白表达量。结果正常缺氧组较正常组（Х^2=25．360）、高糖缺氧组较高糖组（Х^2=17．400）、高糖缺氧＋Tn选且较高糖缺氧组（Х^2=9．900）均表现为细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。正常组与高糖组（Х^2=0．010）、正常组与正常＋TTR组、高糖组与高糖＋TTR组、正常缺氧组与正常缺氧＋TTR组之间细胞凋亡率比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。Westernblot检测结果显示，各组Akt蛋白表达比较，差异无统计学意义（F=2．450，P〉0．05）。正常缺氧组较正常组（t=9．406、5．306、4．819、-4．503）、高糖缺氧组较高糖组（t=8．877、7．723、6．500、-14．646）均表现为P．Akt、eNOS、Bcl-2蛋白表达量明显减少，Bax蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。与正常缺氧组比较，正常缺氧＋TTR组P．Akt蛋白表达量增加（户一5．024，P〈0．05），差异有统计学意义（P〈0．05）；eNOS、Bcl-2、Bax蛋白表达量无明显变化，差异无统计学意义（卢一2．235、-2．656、-0．272，P〉0．05）。与高糖缺氧组比较，高糖缺氧＋TTR组P．Akt、Bcl-2蛋白表达量明显减少（t=4．355、4．308），Bax蛋白表达量明显增加（t=-4．311），差异有统计学意义（P〈0．05）；eNOS蛋白表达量无明显变化，差异无统计学意义（t=-1．590，P〉0．05）。高糖组与正常组、正常＋TTR组与正常组、高糖＋TTRN与高糖组之间P—Akt、eNOS、Bcl-2、Bax蛋白表达量比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论高糖缺氧环境下TTR对hREC生长抑制作用的机制与Akt／Bcl-2／Bax信号通路有关，而与Akt／eNOS信号通路无关。

4-羟基壬稀酸刺激人视网膜微血管内皮细胞的定量蛋白质组学研究

目的观察4-羟基壬稀酸(4-HNE)刺激人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)增生后蛋白表达变化。方法培养对数生长期hRMECs,并将其分为4-HNE刺激组和阴性对照组。4-HNE刺激组加入浓度分别为5、10、20、50 μmol/L的4-HNE培养基,并据此再分为不同浓度亚组;阴性对照组加入等体积无水乙醇(4-HNE的溶剂)培养基。刺激细胞24 h后加入CCK-8孵育4 h,检测吸光度[A,旧称光密度(OD)]值。采用基于超滤辅助样品制备酶切方法进行蛋白质谱样本制备,非数据依赖的采集模式采集数据,并对差异表达蛋白结果进行基因注释分析和通路富集分析。结果CCK-8增生分析法结果显示,10、20 μmol/L 4-HNE刺激组A值均高于阴性对照组和5 μmol/L 4-HNE刺激组,差异有统计学意义(F=25.42,P<0.05);10、20 μmol/L 4-HNE刺激组之间A值差异无统计学意义(P>0.05);50 μmol/L 4-HNE刺激组A值较阴性对照组低,差异有统计学意义(F=25.42,P<0.05)。质谱共鉴定出2710个可定量蛋白。与阴性对照组比较,10 μmol/L 4-HNE刺激组差异表达倍数大于1.5倍的蛋白118个,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,上调蛋白72个,下调蛋白46个。10 μmol/L 4-HNE刺激组血红素氧合酶1、磺胺嘧啶1、热休克蛋白A1B、硫氧还蛋白还原酶1、谷胱甘肽还原酶、三磷酸腺苷(ATP)酶和凝血酶原等蛋白表达增加;载脂蛋白A1和程序性细胞凋亡因子4等表达降低。差异蛋白主要参与氧化应激、细胞解毒、ATP偶联的膜转运等生物学进程。结论4-HNE刺激hRMECs时通过改变氧化应激、细胞解毒相关蛋白、ATP膜偶联等蛋白的表达,共同调控细胞氧化应激和生长状态。

富里酸干预缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞基因表达谱的MiSeq测序分析

目的观察富里酸(FA)干预缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)基因表达谱的MiSeq测序分析结果。方法体外培养hRMEC,并将其分为缺氧组(缺氧处理)和FA干预组(即缺氧后FA干预)。采用MTT比色法检测不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC活性的影响。选择FA的最佳作用浓度,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)验证FA对缺氧诱导hRMEC中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β等炎症因子及炎症相关因子mRNA表达的影响。收集处于对数生长期的缺氧组和FA干预组细胞,应用MiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,在此基础上分析差异表达的miRNA;通过基因注释(GO)功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。组间炎症因子及炎症相关因子表达比较时,通过miRNA mimic调节细胞中相应miRNA的表达水平,观察其对细胞功能的影响,从而判断该miRNA的作用。结果不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC的细胞活性无影响。RT-PCT检测结果显示,缺氧组hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表达较正常组明显上调,差异有统计学意义(t=3.426、6.011、5.282、6.500,P=0.027、0.004、0.006、0.003);FA干预组hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表达较缺氧组明显下降,差异有统计学意义(t=9.961、3.676、3.613、3.387,P=0.001、0.021、0.023、0.028)。缺氧组和FA干预组之间共有14个差异表达miRNA,其中上调基因9个,下调基因5个。共4个差异miRNA(hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3170、hsa-miR-7976)的预测靶基因均为ICAM-1。GO功能显著性富集分析结果显示,差异基因的功能主要富集在细胞发育、细胞分化和单生物发育过程中。KEGG通路显著性富集分析结果显示,差异miRNA表达高度富集的是癌症中蛋白多糖通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路,差异表达较明显的是花生四烯酸代谢通路和安非他明成瘾性通路。结论FA可能通过调控多个miRNA的表达,影响下游ICAM-1 mRNA的表达水平,从而对缺氧刺激hRMEC后细胞的炎性状态产生影响。