小鼠骨髓成熟与不成熟树突状细胞中RelB基因的表达

目的:探讨体外分离培养的小鼠骨髓来源的成熟与未成熟DC中核转录因子RelB(avianreticuloendotheliosisviral(v-rel)oncogenerelatedB)基因的表达。方法:无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导骨髓前体细胞产生未成熟的DC,未成熟的DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的DC,用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟与未成熟DC中,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果:流式细胞术分析显示未成熟的DC中MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子(CD86和CD40)呈低水平表达;而成熟的DC则呈高水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的DC中呈低水平表达;而在成熟的DC中呈高水平表达,两者比较具有统计学意义(P<0.01)。结论:RelB基因的表达与小鼠骨髓来源的DC的成熟状态密切相关。抑制DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。

慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默

目的:利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因,建立RelB基因低表达的骨髓致耐受DC,为自身免疫病的防治提供新方法。方法:设计小鼠RelB基因干扰的靶序列R5,合成并克隆到慢病毒载体上,与慢病毒的包装材料在293FT细胞中包装成病毒颗粒,收集病毒上清,测定病毒滴度,然后包装慢病毒感染DC,RT-PCR和免疫荧光方法检测,灰度扫描并用软件分析RelB基因的表达水平,未成熟DC作对照组,选择T6包装病毒为RNAi的阴性对照。结果:RT-PCR和免疫荧光方法发现R5病毒感染的DCRelB基因表达水平与未成熟DC基因表达水平接近,低于成熟DC的表达水平(P<0.05),而实验对照T6组病毒感染的DC其RelB基因表达水平高于未成熟DC(P<0.05)和R5病毒转染DC组(P<0.05)。结论:小鼠骨髓DC表达的RelB基因被慢病毒载体有效沉默,有望成为DC免疫治疗的新载体。

小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础。方法利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stb13感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度。结果测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存。系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml。结论成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。

RelB小干扰RNA对小鼠前列腺癌细胞RM-1放射治疗敏感性的影响

目的 观察转染RelB小干扰RNA（RelB-siRNA）对小鼠前列腺癌细胞RM-1放射治疗敏感性的影响.方法 将RM-1细胞分为4组,分别为RelB-siRNA组、空载体组、未感染组和正常对照组,分别感染RelB-siRNA慢病毒载体、空载体病毒及不感染病毒,细胞感染成功后,前3组细胞接受X线照射,用细胞克隆方法检测0、2、4、6、8 Gy剂量照射后细胞存活分数和相关参数值;上述4组细胞用Annexin V/PI流式细胞仪检测6 Gy照射剂量下细胞凋亡率,实时PCR检测6 Gy照射剂量下细胞RelBmRNA表达,Western印迹检测6 Gy照射剂量下细胞质和细胞核中RelB蛋白的表达.结果 细胞克隆结果提示,RelB-siRNA组在每个剂量点所对应的存活分数均低于空载体组和未感染组,RelB-siRNA组的细胞平均致死剂量（D0值）、准域剂量（Dq值）、2Gy细胞存活分数（SF2值）分别为1.68、0.60、0.43,低于空载体组（1.92、3.08、0.89）和未感染组（1.93、2.76、0.84）;Annexin V/PI流式细胞仪结果表明,RelB-siRNA组凋亡率为15.27%±1.62%,明显高于未感染组和空载体组的7.90%±1.50%、8.40%±0.69%（P〈0.01）,实时PCR结果显示,RelB-siRNA组的RelBmRNA的扩增倍数1.18±0.03,低于未感染组与空载体组2.10±0.61、1.97±0.66（P〈0.01）;Western印迹检测结果提示,细胞质RelB-siRNA组灰度比值为0.50±0.08,明显低于未感染组和空载体组的1.77±0.19、1.52±0.12（P〈0.01）;细胞质RelB-siRNA组灰度比值为0.18±0.03,明显低于未感染组和空载体组的0.61±0.12、0.54±0.13（P〈0.01）.细胞质RelB-siRNA对RelB蛋白抑制率为71.8%,细胞核RelB-siRNA对RelB蛋白抑制率为70.4%.结论 RelB-siRNA可有效抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1中RelB表达,可明显增加RM-1对放射治疗的敏感性.

科学家发现引起自免疫疾病的基因

本刊讯 据英国最新一期《新科学家》杂志报道,在自身免疫疾病中,一类称为枝状细胞的免疫细胞作出了错误的判断,把人体自身组织认为是外来物。澳大利亚昆士兰大学的科学家通过敲除枝状细胞中特定的基因,纠正了免疫系统的错误行动。 科学家说,对免疫系统进行“