肾小管HIF-1α/miR-23a通路在脓毒血症急性肾损伤中的作用机制

目的探讨肾小管低氧诱导因子-1α(HIF-1α)/MicroRNA-23a(miR-23a)通路在脓毒血症急性肾损伤(SA-AKI)中的作用及相关作用机制。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HK-2细胞),采用脂多糖(LPS)处理HK-2细胞构建SA-AKI细胞模型。LPS处理的HK-2细胞分为LPS组、NC siRNA组、HIF-1αsiRNA组、anti-miR-NC组、anti-miR-23a组、HIF-1αsiRNA+miR-NC组、HIF-1αsiRNA+miR-23a组,以正常培养的HK-2细胞作为空白对照组(Control组)。采用qRT-PCR法检测细胞中HIF-1α、miR-23a基因表达;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞中炎性因子[白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;Western blot法检测细胞中HIF-1α蛋白、NF-κB通路蛋白表达。结果与Control组比较,LPS组HK-2细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达水平、miR-23a mRNA表达水平均升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)。与LPS组比较,HIF-1αsiRNA组HK-2细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达水平、miR-23a mRNA表达水平均降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低(P<0.05)。与LPS组比较,anti-miR-23a组HK-2细胞中miR-23a mRNA表达水平降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低(P<0.05)。与HIF-1αsiRNA组比较,HIF-1αsiRNA+miR-23a组HK-2细胞中miR-23a mRNA表达水平升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)。与Control组比较,LPS组HK-2细胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均升高(P<0.05)。与LPS组比较,HIF-1αsiRNA组和anti-miR-23a组HK-2细胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均降低(P<0.05)。与HIF-1αsiRNA组比较,HIF-1αsiRNA+miR-23a组HK-2细胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均升高(P<0.05)。结论肾小管HIF-1α通过调控miR-23a表达调节NF-κB信号通路,从而参与LPS诱导的肾小管上皮细胞损伤。

Apocynin对缺氧复氧后肾小管上皮细胞凋亡的干预研究

目的研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞凋亡的表达及Apocynin对其影响。方法选用人肾小管上皮细胞(HK2)建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度(0.05、0.25、0.5 mM)Apocynin干预组。流式细胞术检测细胞内氧化应激水平,检测细胞凋亡。结果缺氧复氧后HK2细胞内氧化应激水平提高,HK2细胞凋亡和死亡细胞数量增多,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,凋亡细胞和死亡细胞数量逐渐增多;Apocynin呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系减少凋亡细胞和坏死细胞的数量。结论缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导HK2细胞凋亡和死亡;Apocynin可以通过抑制细胞内氧化应激,减少细胞和坏死细胞的数量。

Apocynin对缺氧复氧后肾小管上皮细胞MCP-1表达的干预作用

目的:研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达及Apocynin对其影响。方法:选用人肾小管上皮细胞(HK-2)建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度(0.05、0.25、0.5mmol/L)Apocynin干预组。流式细胞术检测细胞内氧化应激水平,流式细胞术检测MCP-1蛋白表达、RT-PCR法测定细胞MCP-1mRNA表达。结果:缺氧复氧后HK-2细胞内氧化应激水平提高,细胞MCP-1蛋白和mRNA表达上调,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,MCP-1蛋白和mRNA表达逐渐增强;Apocynin呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系抑制MCP-1蛋白和mRNA表达的上调。结论:缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导MCP-1表达上调;Apocynin可以通过抑制细胞内氧化应激抑制MCP-1的上调。

远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用

目的:研究远隔缺血预处理(RIPC)分离液对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及机制。方法:将HK-2细胞分为时间对照组、H/R、RIPC处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养,RIPC组细胞使用RIPC分离液预处理,自噬干预组细胞在RIPC处理基础上,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA),后三组细胞使用三气培养箱进行H/R构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态,应用Western blot观察LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白的表达水平。结果:镜下示RIPC分离液可明显减轻H/R对HK-2细胞的损伤,加入自噬抑制剂,RIPC分离液对HK-2细胞H/R损伤的保护作用被阻断。Western blot结果显示,RIPC分离液可使HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达水平增高。Real-time PCR结果显示,与H/R组比,RIPC组LC3及Beclin1的mRNA表达量明显升高;加入自噬抑制剂,HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低,LC3及Beclin1的mRNA表达量同时也明显降低。结论:RIPC分离液对HK-2细胞H/R后损伤具有保护作用,作用机制可能与线粒体自噬相关。

缺氧/复氧后肾小管上皮细胞ICAM-1表达及Apocynin对其干预作用的研究

目的:研究缺氧/复氧后肾小管上皮细胞氧化应激的变化细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白和mRNA的表达及NADPH氧化酶抑制剂Apocynin对其的影响。方法:采用肾小管上皮细胞(HK2)建立缺氧(细胞置于37℃、95%N_2、5%CO_2环境中)/复氧(细胞置于37℃、95%O_2、5%CO_2环境中)细胞模型,设正常对照组,缺氧0.5 h、1 h、2 h/复氧24 h组,及不同浓度(0.05 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L)Apocynin干预组。流式细胞术检测细胞内氧化应激水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定细胞ICAM-1 mRNA表达,流式细胞术检测ICAM-1蛋白表达。结果:缺氧/复氧后HK2细胞内氧化应激水平提高,ICAM-1 mRNA和蛋白表达增强,随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,ICAM-1mRNA和蛋白表达也逐渐增强;Apocynin呈剂量依赖关系抑制细胞内氧化应激和ICAM-1 mRNA、蛋白表达的上调。结论:缺氧/复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导ICAM-1表达上调;Apocynin可以通过抑制细胞内氧化应激抑制ICAM-1的上调。

白藜芦醇对缺氧复氧致肾小管上皮细胞内质网应激和炎性损伤的影响

目的 探讨白藜芦醇对缺氧复氧致肾小管上皮细胞内质网应激和炎性损伤的影响。方法 将HK-2细胞分为对照组、模型组、白藜芦醇组,其中对照组放于37℃、95%空气及5%CO_(2)的培养箱中培养;模型组按照缺氧复氧处理方法培养;白藜芦醇组在缺氧复氧处理时换成含50 mg/L白藜芦醇的培养液,按照缺氧复氧处理方法培养。采用DCFH-DA检测细胞活性氧水平;采用流式细胞仪测定细胞凋亡率;采用Western blot法测定内质网应激蛋白糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达;采用ELISA法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平。结果 模型组细胞活性氧表达明显增强,而白藜芦醇组细胞活性氧表达降低。模型组和白藜芦醇组细胞凋亡率高于对照组,而白藜芦醇组细胞凋亡率低于模型组(P<0.05)。模型组和白藜芦醇组GRP78和CHOP表达高于对照组,而白藜芦醇组GRP78和CHOP表达低于模型组(P<0.05)。模型组和白藜芦醇组TNF-α和IL-1β水平高于对照组,而白藜芦醇组TNF-α和IL-1β水平低于模型组(P<0.05)。结论 白藜芦醇可减轻缺氧复氧致肾小管上皮细胞凋亡,降低缺氧复氧致肾小管上皮细胞内质网应激和炎症因子水平,减轻炎性损伤。

HIF-2α通过调控NEK1表达减轻肾小管上皮细胞缺氧损伤的研究

目的探讨缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的作用及机制。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HK-2细胞),以2.5μmol/L抗霉素A作用24 h构建缺氧HK-2细胞模型,采用qRT-PCR法和Western blot法检测HIF-2α在正常HK-2细胞和缺氧HK-2细胞中的表达;将HIF-2α干扰序列(siRNA-HIF-2α)及其阴性对照(siRNA-NC)、NIMA相关激酶-1(NEK1)过表达质粒(pcDNA3.0-NEK1)及空载体质粒(pcDNA3.0-NC)转染至缺氧HK-2细胞后,采用CCK-8法检测缺氧HK-2细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI双染法检测缺氧HK-2细胞凋亡率,qRT-PCR法和Western blot法检测缺氧HK-2细胞中NEK1表达。结果与正常HK-2细胞比较,缺氧HK-2细胞中HIF-2αmRNA和蛋白表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与Control组比较,Hypoxia组细胞增殖活性降低、细胞凋亡率升高、细胞中NEK1 mRNA和蛋白表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与Hypoxia组比较,si-NC组细胞增殖活性、细胞凋亡率、细胞中NEK1 mRNA和蛋白表达量均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与si-NC组比较,si-HIF-2α组细胞增殖活性降低、细胞凋亡率升高、细胞中NEK1 mRNA和蛋白表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与si-HIF-2α组比较,si-HIF-2α+pcDNA3.0-NC组细胞增殖活性、细胞凋亡率均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与si-HIF-2α+pcDNA3.0-NC组细胞比较,si-HIF-2α+pcDNA3.0-NEK1组细胞增殖活性升高、细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-2α可能通过调控NEK1表达促进缺氧HK-2细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而减轻HK-2细胞缺氧损伤。

人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的建立一种新的人近曲肾小管上皮细胞HK2缺氧/复氧损伤模型。方法本实验使用人近曲HK2。实验分为缺氧4、12和24h及缺氧24h后复氧4、12和24h组,每个实验组均设立空白对照组。采用经高温灭菌的液体石蜡覆盖法造成缺氧环境;苔盼兰摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,生化法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果人肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,苔盼兰摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高。说明缺血再灌注损伤导致了细胞膜的完整性破坏,甚至细胞发生了不可逆转的损伤。结论采用液体石蜡覆盖法建立人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法操作简单、易行、可靠。

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。

内质网应激在大鼠肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤炎症反应中的作用

目的观察大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)缺氧复氧损伤时内质网应激蛋白和炎症细胞因子表达的改变及其意义,以探讨缺氧复氧诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激与炎症反应的关系。方法 NRK-52E细胞用含5%胎牛血清的DMEM液培养于37℃、5%CO2恒温培养箱。将细胞分为正常对照组和缺氧/复氧损伤(hypoxia reoxygenation,H/R)组。采用全自动生化分析仪检测细胞培养液上清LDH活性,Western blot方法检测GRP78、CHOP蛋白表达,ELISA法检测细胞上清IL-β水平。结果①与对照组细胞培养液上清LDH(22.07±1.23)U/L比较,H/R损伤组(45.93±6.42)U/L显著增加(P<0.05)。②与对照组肾小管上皮细胞GRP78表达(0.80±0.04)比较,H/R损伤组(1.24±0.04)明显增加(P<0.05)。③与对照组肾小管上皮细胞CHOP表达(0.81±0.05)比较,H/R损伤组(1.19±0.05)明显增加(P<0.05)。④与对照组IL-1β水平(6.55±2.03)pg/ml比较,H/R损伤组(14.93±2.26)pg/ml显著增加(P<0.01)。结论缺氧复氧可以诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激与炎症反应。内质网应激上调CHOP表达可能在肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤炎症反应中具有重要作用。

动力相关蛋白-1在缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用

目的观察人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤时线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,Nlrp3)以及炎性因子的表达改变和细胞焦亡情况,探讨Drp1在H/R诱导肾小管上皮细胞焦亡中的作用。方法 HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12液培养于37℃、5%CO2和95%O2的恒温培养箱。将细胞分为正常对照组、H/R组、H/R+Drp1抑制剂(H/R+Mdivi-1)组、H/R+si Nlrp3腺病毒(H/R+si Nlrp3)组、H/R+空腺病毒(H/R+Scra)组。检测细胞培养液上清乳酸脱氢酶LDH活性,Western blot检测Drp1、Nlrp3、凋亡相关蛋白-1(caspase-1)、IL-1β表达,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞活性氧(ROS)水平,流式分析仪检测细胞焦亡情况。结果与正常对照组比较,H/R组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显升高,Drp1、Nlrp3、caspase-1、IL-1β表达增高,细胞焦亡明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,H/R+Mdivi-1组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显降低,Nlrp3、caspase-1、IL-1β表达降低,细胞焦亡明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在H/R条件下,Drp1通过激活Nlrp3炎性体诱导人肾小管上皮细胞焦亡。

脯氨酸羟化酶抑制剂对人肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探讨脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)通过稳定人肾小管上皮细胞(HKC)中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达抗缺氧/复氧损伤(HRI)的作用及其机制。方法无糖缺氧12 h,复氧6 h制作HKC细胞HRI模型,分别于缺氧前2、4、6、12 h给予DMOG预处理,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖活性,试剂盒检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,Annexin/PI染色流式细胞仪技术检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR方法检测bcl-2和bax mRNA的表达,Western印迹检测HIF-1α、bcl-2和bax蛋白的表达。结果 DMOG预处理使HKC中HIF-1α表达增加,细胞损伤明显改善,表现为细胞增殖活性提高,培养上清液中MDA含量下降、SOD活性增强,细胞凋亡率下降(P<0.05);同时baxmRNA和蛋白表达下调(P<0.05),bcl-2 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)。结论 DMOG可通过稳定HIF-1α,影响凋亡相关基因的表达,改善HRI诱导的HKC细胞损伤。

中介素对缺氧/复氧大鼠肾小管上皮细胞增殖作用及细胞周期的影响及其机制

目的探讨中介素(intermedin,IMD)对大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧(H/R)后细胞增殖、细胞周期的影响。方法 NRK-52E细胞随机分为对照组,模型组:缺氧/复氧组(H/R)、H/R+空质粒组、H/R+IMD质粒组。MTT法检测细胞增殖,比色法检测培养基上清LDH含量,流式细胞术检测细胞周期,Real time-PCR法和Western blot法检测cyclin D1、CDK、p57 mRNA及蛋白表达,间接免疫荧光染色检测cyclin D1亚细胞定位。结果 1与对照组相比,H/R组培养基中LDH含量升高了106%,同时细胞存活率明显下降,与H/R组比较,H/R+IMD组培养基中LDH含量下降了33.85%(P<0.01),而细胞存活率增高(79.15%±1.42%vs 61.22%±1.63%,P<0.05),2细胞周期结果显示,与对照组相比,H/R组细胞G0/G1期比例增加,S期细胞比例降低(P<0.05);与H/R组比较,H/R+IMD组G0/G1期细胞比例明显降低,而S及G2期细胞比例增加(P<0.05)。3H/R可增加cyclin D1、CDK4及p57的表达也增加(与对照组比较,P<0.05);而IMD可进一步上调cyclin D1、CDK4的表达,同时下调p57的表达,与对照组及H/R组相比差异具有显著性(P<0.05)。4免疫荧光检测结果可见,cyclin D1呈红色荧光,在NRK-52E细胞内主要表达在细胞核中。结论 IMD可以上调cyclin D1、CDK4蛋白表达,下调p57的表达,促进细胞周期进展,从而加速肾组织IRI后细胞增殖和修复。

肾小管上皮细胞S期细胞凋亡过度与G_1/S细胞低氧暴露的关系

目的:探讨肾上管上皮细胞(RTEs)S期细胞凋亡过度与G1/S界面细胞低氧直接暴露的关系。方法:采用NaCN体外细胞化学性低氧法进行G1/S新生猪RTEs低氧干预研究,分别应用反相高效液相法、流式细胞术细胞DNA含量PI染色分析法和流式细胞术间接细胞免疫化学法进行低氧/再给氧各观察点细胞内ATP含量、细胞周期时相和凋亡细胞分布率以及热休克蛋白(HSP27和HSP70)表达量的检测。并采用磷蛋白磷酸酶(PP2A)抑制剂斑蝥素进行NaCN介导的细胞蛋白质脱磷酸化抑制研究,比较HSP27和HSP70在磷酸化与脱磷酸化状态下细胞凋亡的发生率。结果:受低氧直接暴露的G1/S新生猪RTEs在S期细胞凋亡比率显著高于PP2A抑制组和空白对照组(P<0·01),此时细胞内ATP含量显著低于后两组(P<0·05),而细胞内HSP27和HSP70的表达量则均高于后两组(P<0·01)。结论:新生猪RTEs发生S期细胞凋亡过度与其G1/S低氧直接暴露密切相关,其可能机制与NaCN化学性低氧介导的S期HSP27和HSP70的脱磷酸化有关。

24p3/NGAL介导铁转运通过抑制肾小管上皮细胞凋亡减少急性肾损伤

目的:阐明24p3/NGAL介导铁转运对急性肾损伤肾小管上皮细胞的保护作用。方法:用分子克隆的方法构建Pc DNA3.1/24p3质粒,采用脂质体转染的方法瞬时转染小鼠胚胎成纤维(NIH/3T3)细胞;实时荧光定量PCR及ELISA验证24p3在NIH/3T3细胞中的表达,以未转染质粒的空白组和转染空载体质粒组作为对照,RT-PCR检测各组细胞24p3mRNA水平,ELISA检测各组细胞培养上清中24p3水平,收集各组上清液;用氯化钴缺氧诱导小鼠肾小管上皮(TCMK-1)细胞,用收集的NIH/3T3细胞上清液在正常铁离子浓度下培养,流式细胞仪检测各组TCMK-1细胞凋亡情况。结果:转染Pc DNA3.1/24p3质粒后的NIH/3T3细胞24p3mRNA和蛋白表达水平明显增加,证实转染成功;与对照组相比,加入重组质粒转染组上清液的TCMK-1组凋亡细胞数量明显减少(P<0.05)。结论:24p3/NGAL介导的铁转运通过抑制肾小管上皮细胞的凋亡,减少急性肾损伤。

缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞蛋白质组表达变化的初步研究

目的:采用将人肾小管上皮细胞置于缺氧环境中然后复氧的方法模拟缺血再灌注(ischemia reper-fusion,IR)所致肾损伤的发生和发展过程,研究IR对人肾小管上皮细胞表达蛋白质组的影响。方法:人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)常规培养,随机分为2组,IR组缺氧培养8h,然后复氧培养24h,对照组常规培养,裂解细胞,提取全细胞蛋白。双向电泳(2-DE)分离,ImageMaster2D Platinum V5.0软件进行差异表达蛋白质组分析,基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质。结果:通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与HK-2缺氧复氧诱导的差异表达蛋白斑点为109个;经质谱鉴定的7个差异表达的蛋白斑点包括:核糖体蛋白S2、普通转录因子ⅡH亚基1变体、双链断裂修复蛋白rad-21同源物、富含亮氨酸重复序列蛋白-45、DNA依赖性蛋白激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶Chk1和程序性细胞死亡蛋白-4。结论:IR组与对照组的表达蛋白质组相比较存在明显差异;7个与HK-2缺氧复氧诱导表达改变的蛋白质的功能涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导、抗细胞损伤等,提示IR的发生发展与相应的病理生理过程相关。

SIRT1减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的实验研究

目的:研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响。方法:构建缺氧复氧肾小管上皮细胞损伤模型,用qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中SIRT1的表达变化。在肾小管上皮细胞中转染pc DNA3. 1-SIRT1,qRT-PCR和Western blot检测过表达效率。ELISA法检测细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平。Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、Caspase-11蛋白水平。全自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:缺氧复氧肾小管上皮细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均降低。pc DNA3. 1-SIRT1转染后的肾小管上皮细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均明显升高。缺氧复氧肾小管上皮细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平升高,细胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平升高,细胞培养液中LDH水平升高。过表达SIRT1的肾小管上皮细胞经缺氧复氧处理以后,细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平降低,细胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平降低,细胞培养液中LDH水平降低。结论:SIRT1具有减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的作用,其可减少细胞分泌炎性因子,作用机制与内质网应激介导的Caspase-11途径有关。

大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的探讨建立大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧损伤模型的一种新方法。方法本实验使用大鼠NRK-52E细胞。实验分为对照组和实验组,实验组分为缺氧2,4,6h及缺氧后复氧1,12和24h组。缺氧时换用缺氧液,再置入N294%+O21%+CO25%缺氧环境;缺氧后换用含10%胎牛血清的EMDM/F12,置入95%空气+CO25%有氧环境,制作缺氧/复氧模型;台盼蓝摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果大鼠肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,与对照组相比,台盼蓝摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用三气孵箱法建立大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法操作简单、易行、可靠。

胡黄连提取物对缺氧复氧后肾小管上皮细胞氧化损伤的作用

目的研究胡黄连提取物对缺氧复氧后肾小管上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法采用肾小管上皮细胞建立缺氧复氧损伤模型(分别缺氧0.5、1、2 h),取缺氧2 h组分别用不同浓度胡黄连提取物(10、100、1000μg/ml)进行预处理,采用流式细胞术检测不同组细胞凋亡及细胞内氧化应激水平。结果正常情况下肾小管上皮细胞内氧化应激水平非常低,可见极少量凋亡细胞和死亡细胞,与正常对照组相比,各缺氧复氧组细胞内氧化应激水平提高(P<0.05),凋亡细胞和死亡细胞数量明显增多(P<0.05),且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高(P<0.05),凋亡细胞和死亡细胞数量逐渐增多(P<0.05)。与单纯缺氧复氧组相比,不同浓度胡黄连提取物呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平(P<0.05),同时呈剂量关系减少凋亡细胞和坏死细胞的数量(P<0.05)。结论胡黄连提取物可以通过抑制细胞内氧化应激减少肾小管上皮细胞缺氧复氧后细胞凋亡和坏死。

Vasostatin-1对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响

目的探讨血管生成抑制因子vasostatin-1(VS-1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤作用及机制。方法采用缺氧复氧方式制造肾小管上皮细胞炎性损伤。构建慢病毒载体并以脂质体法将shVS-1转染NRK-52E细胞。ELISA法检测细胞中LDH和IL-1β含量;Western blot检测细胞中VS-1、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表达。结果与对照组相比,缺氧复氧组细胞LDH和IL-1β含量显著升高,且VS-1蛋白表达显著升高。成功构建沉默VS-1的慢病毒载体,且转染缺氧复氧NRK-52E细胞,可降低细胞中LDH和IL-1β含量、降低caspase-1蛋白表达,过表达VS-1则具有相反的功能。结论沉默VS-1可保护缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤,可能与下调caspase-1有关,可为急性肾损伤的临床治疗提供依据。