高糖激活PI3K/AKT/mTORC1通路诱导人肾小管上皮细胞骨桥蛋白的表达

目的探讨高糖刺激上调人肾小管上皮细胞株(HK-2)骨桥蛋白(OPN)表达的分子机制。方法利用高糖(25mmol·L-1)刺激HK-2细胞,并应用特异性抑制剂、siRNA抑制PI3K和(或)mTOR活性,应用Real-time PCR检测OPN mRNA表达;Western blot检测OPN、p-AKT、p-S6、Raptor和Rictor蛋白表达。结果高糖刺激呈时间依赖性上调HK-2细胞OPN表达,其中,OPN mRNA在刺激48h后达高峰;OPN蛋白表达在72h达到最高。此外,高糖刺激激活PI3K/AKT/mTORC1信号通路。利用PI3K特异性抑制剂LY294002、mTORC1特异性抑制剂rapamycin抑制PI3K/AKT/mTOR通路后,HK-2细胞的OPN表达明显降低。进一步,siRNA敲低Raptor降低HK-2细胞中OPN蛋白的表达,而敲低Rictor对OPN蛋白表达无影响。结论高糖通过激活PI3K/AKT/mTORC1通路上调HK-2细胞OPN的表达。

PPARγ通过PTEN调控AKT/FAK通路影响高糖条件下肾小管上皮细胞转分化

目的:探讨在高糖培养的肾小管上皮细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)对PTEN/AKT/FAK通路的调控机制及对肾小管上皮细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:以高糖培养的肾小管上皮细胞NRK52E为研究对象,采用过表达及shRNA干扰技术分别上调和下调肾小管上皮细胞中PPARγ的表达,并培养48 h,应用细胞免疫荧光、Western blot和RT-qPCR方法检测PTEN及EMT相关蛋白的表达变化;然后,在过表达及敲减PTEN的情况下,分别给予PPARγ抑制剂GW9662及激动剂罗格列酮干预,进一步观察PPARγ对AKT/FAK通路的调节是否通过PTEN实现的。结果:过表达PPARγ组PPARγ和PTEN的mRNA及蛋白表达增加,E-cad⁃herin的表达明显上调,而vimentin和α-SMA蛋白表达显著下调(P<0.05);PPARγ敲减组PPARγ及PTEN的mRNA及蛋白表达水平明显降低,E-cadherin的表达也明显下调,而vimentin和α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.05)。GW9662干预组PTEN的表达减少,而p-AKT(Thr308)、FAK及p-FAK(Tyr397)蛋白水平均明显升高(P<0.05);与GW9662组相比,GW9662+过表达PTEN组PTEN表达明显增加,并伴随p-AKT(Thr308)、FAK及p-FAK(Tyr397)蛋白水平的降低(P<0.05);罗格列酮干预组PTEN的表达增多,而p-AKT(Thr308)、FAK和p-FAK(Tyr397)蛋白水平降低(P<0.05);与罗格列酮组相比,罗格列酮+PTEN shRNA组PTEN的表达减少,相应的p-AKT(Thr308)、FAK和p-FAK(Tyr397)蛋白水平升高(P<0.05)。结论:PPARγ能调节肾小管上皮细胞PTEN的mRNA及蛋白表达水平,并影响肾小管上皮细胞的EMT;PPARγ对AKT及FAK通路的调节及对细胞EMT的影响主要是通过PTEN实现的。