猪圆环病毒3型Rep蛋白的原核表达及酶活性分析

Rep蛋白对猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)的复制具有重要作用。为分析PCV3 Rep蛋白的核酸内切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性,作者使用镍亲和层析法纯化相应的重组蛋白,通过优化反应条件,建立Rep蛋白酶活性的测定方法,并探究Rep蛋白关键活性位点。结果表明,Rep蛋白在体外具有核酸内切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性。当蛋白浓度为1.6μmol·L^(-1),Mg^(2+)浓度为1.0 mmol·L^(-1),37℃反应75 min时其ATPase活性达到最佳。当蛋白浓度为7μmol·L^(-1),Mg^(2+)浓度为12.5 mmol·L^(-1),37℃反应60 min时其解旋酶活性达到最佳。Y89为Rep蛋白核酸内切酶活性的关键位点,K173、D210、N250为ATPase活性和解旋酶活性的关键位点。本研究建立了PCV3 Rep蛋白酶活性分析的方法,初步揭示了该蛋白的主要功能位点,为Rep蛋白的功能研究以及基于Rep蛋白活性的抗病毒药物研究奠定了基础。

猪圆环病毒2型Rep和Rep’蛋白免疫原性及其抗体中和活性的测定

为了构建表达PCV2Rep和Rep’蛋白的重组杆状病毒,采用高保真PCR法从病毒感染细胞中扩增Rep和Rep’蛋白基因,并克隆到杆状病毒转移载体(pBlueBac4.5/V5-His-TOPO)。将重组质粒与线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞(Sf21),经同源重组和蚀斑筛选,获得2株高效表达PCV2Rep和Rep’蛋白的重组杆状病毒。经3次克隆的重组毒株的毒价达3.0×107 PFU/mL和7.0×107 PFU/mL。蛋白表达产物分析表明,PCV2Rep和Rep’蛋白分子质量为36.0ku和20.4ku,分别占总蛋白含量的6.2%和10.1%。免疫活性分析表明,这2种重组蛋白均可与PCV2特异性抗体产生反应,具有良好的反应原性。用Ni-NTA亲和层析法纯化这2种重组蛋白,纯度分别为92.5%和93.6%。用纯化的2种蛋白免疫小鼠,经间接ELISA检测,血清抗体效价高达1∶51 200。以抗这2种蛋白的抗体进行的IPMA试验表明,它们均能特异性识别PCV2感染细胞中的Rep和Rep’蛋白抗原。病毒血清中和试验证实,抗Rep和Rep’蛋白抗体均无中和病毒活性。本研究表达的重组PCV2Rep和Rep’蛋白,为探讨该病毒复制机制奠定了基础,也为PCV2Cap亚单位疫苗与自然野毒感染间的鉴别诊断开辟了新途径。

猪圆环病毒2型Rep/Rep'和Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护性试验

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制备亚单位疫苗及PCV2灭活苗,分组免疫BALB/c鼠进行攻毒,以评价疫苗的免疫保护力。对PCV2-rRep和-rRep'亚单位疫苗免疫鼠血清ELISA抗体检测表明,于免疫后第14 d抗体全部转阳,第35 d抗体效价分别达到1∶42 667和1∶51 200。PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫组于第21 d抗体转阳,第35 d抗体效价分别达1∶2 133和1∶333。攻毒试验表明,PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠获得完全保护;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫组无保护作用。血清中和试验表明,PCV2-rCap蛋白亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠血清中和抗体效价达1∶1 600和1∶800;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫鼠血清无中和病毒能力。该研究表明,PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫保护力,可以与PCV2自然感染猪产生的抗Rep蛋白抗体相鉴别,具有良好的开发前景。

猪圆环病毒2型Rep蛋白ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的方法,本研究通过基因合成PCV2的Rep编码序列,将其克隆至pET-28a(+)并在E.coli中表达,表达的重组Rep蛋白经Ni2+亲和纯化。采用纯化的目的蛋白作为包被抗原,建立检测PCV2 Rep蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,血清和二抗最佳反应时间分别为1 h和30 min。该方法具有良好的特异性和敏感性,与韩国金诺公司试剂盒的符合率为81.4%,表明建立的ELISA方法可以用于PCV2的流行病学检测。

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。

猪圆环病毒4型Rep蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。

猪圆环病毒1型和2型Rep蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

分别以猪圆环病毒1型基因组和重组质粒pCI-PCV2-ORF1为模板,利用PCR扩增了猪圆环病毒1型和2型的ORF1基因,随后克隆到pET-28a(+)和pET-32a(+)两种原核表达载体上。测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3),进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,猪圆环病毒1型和2型的ORF1均能在pET-28a和pET-32a中分别以重组蛋白His-Rep(40 Ku)和Trx-His-Rep(54 Ku)的形式表达。进一步纯化后测定重组蛋白的浓度,推算出猪圆环病毒1型和2型的His-Rep蛋白产量分别为34 mg/L菌液和14 mg/L菌液,Trx-His-Rep蛋白产量则为12 mg/L菌液和10 mg/L菌液。这些纯化的蛋白在Western blot中能够与猪抗猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应,显示其具有良好的免疫学活性。本研究建立的猪圆环病毒重组Rep蛋白的原核表达系统及其纯化方法,为下一步开展Rep蛋白功能等相关研究奠定了基础。

香蕉束顶病毒Rep蛋白特性分析及纯化体系的建立

以香蕉束顶病毒海口分离物DNA1(Accession NO.FJ463042)的Rep蛋白为研究对象,利用生物信息学软件对该蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、磷酸化、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测,并配置了相关纯化试剂。将含重组质粒pET32b-Rep的E.coli BL21(DE3),接种到LB液体培养基,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4 h,产生大量的可溶性重组蛋白,经AKTA Explorer100系统亲和层析柱后,用不同梯度的Washing buffer洗脱杂蛋白并对各阶段产物进行12%SDS-PAGE分析,确定了100mmol/L咪唑的Washing buffer洗脱浓度,最终获得大量高纯度的重组蛋白。以His*Tag Monoclonal Antibody为一抗,Western blot鉴定结果表明纯化重组蛋白即为His-Rep融合蛋白。该纯化体系的建立为研究BBTVRep蛋白的结晶奠定了基础,也为今后ABTV、FBNYV、MVDV、PNYDV等病毒的相关复制蛋白纯化提供了重要数据。

猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep'蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表明,该MAb可与重组杆状病毒表达的PCV2-rRep'和PCV2-rRep蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性和反应原性。采用MAb对PCV2感染细胞中Rep'蛋白抗原性进行了鉴定,证明该MAb能够与病毒Rep'蛋白产生特异性反应。采用合成肽扫描法对MAb对应的抗原表位鉴定,其核心序列为61FANFVKKQTFNKV73,位于PCV2-Rep'蛋白的N末端。制备的MAb及其抗原表位鉴定,为该病毒分子生物学及诊断技术的研究奠定了基础。

猪圆环病毒Ⅱ型rep蛋白的亚细胞定位生物信息学析

从GenBank发表的PCV-2全基因组序列,随机选择其中的32个全基因序列,做序列比对和同源性比较,绘制系统进化树,在注释中找到ORF1编码的rep蛋白氨基酸序列,用在线生物信息学工具对其进行亚细胞定位分析。结果基本符合"来自同一地区的基因序列同源性较高"的规律,表明了PCV的高度保守性,亚细胞定位分析发现其rep蛋白定位于核区的指数为0.76,这与病毒在宿主细胞核内复制分不开。结果同时表明其定位于过氧化物酶体的指数显著不同于其他(过氧化物酶体平均0.36,可变,溶酶体、线粒体均为0.1不变)这可能与pcv的组织嗜性以及复制靶细胞(多为单核/巨噬细胞)的原因相关。

PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响

N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。

腺相关病毒Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的体外研究

目的研究腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)Rep78蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用及机制。方法将土拨鼠肝炎病毒(WHV)全基因组DNA从质粒中酶切回收,线状DNA重新连接呈环状。用脂质体Fugene6体外转染至HepG2细胞,同时共同转染含有Rep78的质粒AAVdl52-91。5d后收获细胞DNA,Southernblot检测WHVDNA复制。以含有HBV全长的质粒为模板,PCR法分别扩增出HBV-S、C和X基因全长。以凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测Rep78与HBV-S、C和X的结合。结果Southernblot结果表明,AAV-Rep78可以明显抑制WHV病毒在HepG2细胞中的复制,并呈剂量依赖关系。EMSA结果显示,Rep78蛋白在体外能够与HBV-S、C和X的DNA结合,其中与HBV-C的结合最强而且有剂量依赖关系。此外,这种Rep78蛋白与HBV-CDNA结合可以被特异性的Rep78抗体阻滞,形成超结合带。结论AAV-Rep78可以抑制HBVDNA的复制,其机制可能在于Rep78蛋白结合并抑制了HBV-C基因。

腺相关病毒主要调控蛋白Rep78的表达及其与HBV-X基因启动子的体外结合

目的对腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)Rep78蛋白对乙肝病毒X启动子(HBV-X promoter)的可能作用进行初步研究。方法利用pMAL-Rep78(含有Rep78全长基因的表达质粒)在大肠杆菌中表达并纯化得到带有AAVRep78蛋白的MBP-rep78融合蛋白;通过SDS-电泳及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。合成地高辛标记的X启动子3段探针;以非放射性凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测Rep78与HBV-X启动子的结合。结果得到纯化的MBP-rep78融合蛋白;EMSA结果显示Rep78蛋白在体外能够与HBV-X启动子DNA结合,并有剂量依赖关系。结论AAVRep78可以与HBV-X启动子结合。

猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度>90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。

腺相关病毒Rep78/68蛋白

腺相关病毒(AAV)编码的非结构蛋白Rep78/68具有抑制病毒和肿瘤转化的作用,并且对宿主细胞的增殖及代谢产生广泛地影响。本文将对此蛋白的最新研究进展进行综述。

Cap和Rep蛋白在猪圆环病毒2型复制中的作用

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员,包括猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）。1974年,PCV1首次分离自PK-15细胞系[1],该病毒在猪群中广泛存在,

猪圆环病毒2型Rep蛋白在真核细胞中的表达与定位

为了构建Rep蛋白真核表达质粒,研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因,并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示,重组的pEGFP-PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h,PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。

腺相关病毒Rep78/68蛋白功能的研究进展

Rep78/68是腺相关病毒(AAV)基因组编码的具有多种调控功能的非结构蛋白。主要参与了AAV DNA定点整合到人类19号染色体,抑制病毒的生物活性,如腺病毒、类猿病毒SV40等,调节AAV DNA的复制和转录等。重点阐述了定点整合的作用机制,Rep78/AAV ITR/ICP8复合物的形成机制以及Rep68蛋白的寡聚化特性,Rep78蛋白对p53核输出的限制,AAV Rep78蛋白与人乳头瘤病毒(HPV)E1蛋白相互作用从而促使Rep78和ITR DNA的结合,Rep78对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制。这些作用的详细机制仍需完善和充实,对Rep78/68蛋白的相关作用机制的深入研究有助于rAAV基因药物的研发。

番鸭细小病毒Rep1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Rep蛋白在番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)感染中的作用尚不清楚。研究将MDPV的Rep1基因克隆入p ET-28a原核表达载体并转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG诱导下成功表达了分子量约为82 ku的目的蛋白,菌体分析表明目的蛋白主要以包涵体存在。将重组蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对Rep1蛋白的多克隆抗体。在间接免疫荧光试验中,Rep1多克隆抗体能与鹅胚成纤维细胞上增殖的MDPV特异性发生反应,免疫印迹试验则显示Rep1多克隆抗体能够在MDPV感染的GEF中识别出两条蛋白条带Rep1和Rep2。结果表明制备的Rep1多克隆抗体具有良好反应特异性,为深入研究Rep蛋白在MDPV感染中的作用奠定了基础。

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。