CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。

三江源地区鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及流行特征研究

目的了解三江源地区鼠疫菌株分布情况,进行规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats)基因分型研究,为该地区鼠疫疫源地菌株鉴定溯源、科学防控提供理论依据。方法选取三江源地区310株鼠疫菌提取DNA,分别PCR扩增、测序3个CRISPR的位点YPa、YPb和YPc,所测得CRISPR序列与CRISPR Dictionary数据库最新数据进行比对,鉴定CRISPR spacer阵列并对三江源地区鼠疫菌进行基因分型。对310株鼠疫菌结合CRISPR基因型和分离宿主信息进行统计分析。结果310株鼠疫菌共发现26种spacer,分别为YPa15种、YPb8种、YPc3种;310株鼠疫菌被分成16个不同CRISPR基因型,G22型和G22-a1′型分布于整个三江源地区包括称多县、治多县、玉树市、曲麻莱县、囊谦县、杂多县、玛多县、玛沁县、同仁县、泽库县、共和县、同德县、贵德县;G24型分布于泽库县、玛多县、囊谦县、称多县;G26-a1′型主要分布于共和县、兴海县、贵德县、玛多县、称多县、杂多县,16个基因型归类为7个CRISPR类群:Cb4、Cb4′、Ca7、Ca7′、Ca8、Ca35′、Cc3′。结论三江源地区鼠疫菌CRISPR基因型具有多样性,不同疫源地基因型分布特征显著,且不同菌株基因型存在差异。

利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。小鼠出生后取其基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)和测序以鉴定基因型,鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。小鼠心脏组织经甲醛固定并制成切片后分别进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。提取小鼠心脏组织总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和Western印迹验证基因敲除小鼠的有效性和检测互作蛋白表达。结果 获得F1代PPP2R3A杂合小鼠,PCR和测序结果表明突变小鼠的基因型存在113 bp的缺失突变。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA和蛋白表达量明显下降(均P<0.05),参与心脏发育的G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达量明显升高(P<0.05)。PPP2R3A蛋白表达受损引起了心脏组织病理学变化。结论 PPP2R3A在体内可能通过与RGS19蛋白互作来参与心脏的发育并对心脏功能产生影响。

CRISPR/Cas系统在核酸检测中的应用和挑战

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测。但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等。随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用。本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评。

利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

基于CRISPR/Cas9的棉花GhbHLH71基因编辑突变体的分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在植物的生长发育、次生代谢、信号转导、逆境胁迫等方面起重要的调控作用。棉花GhbHLH71基因c DNA全长996 bp,编码331个氨基酸残基,蛋白序列中含有保守的bHLH结构域,属于bHLH转录因子家族成员。实时荧光定量分析结果表明,GhbHLH71基因在棉花纤维快速伸长期3~12 DPA (days post anthesis,DPA)相对高表达,暗示其主要在棉花纤维发育过程中发挥作用。构建该基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行了棉花遗传转化,T_0代再生株经过Cas9基因的PCR检测以及靶位点突变情况检测分析,获得6个T_0代基因编辑突变体。T_1代不同突变株系在棉花生长发育期的表型性状与对照相比无明显差异,但成熟纤维的长度与对照相比皆明显变短。T_2代突变株系可以稳定遗传T_1代株系纤维变短的表型。其中4#和8#株系连续2代的纤维长度与对照相比缩短比率皆达20%以上,表明GhbHLH71基因的突变主要影响了棉花纤维细胞的伸长。本研究为深入了解棉花中bHLH转录因子的生物学功能以及棉花纤维发育的分子机制提供了一定的参考。

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。

利用CRISPR/Cas9技术编辑GmBADH1基因改变大豆耐盐性

耐盐基因功能鉴定对于大豆品种改良以及盐碱地的开发利用至关重要。盐害胁迫下作物通过合成和积累甜菜碱作为渗透保护剂,减小盐害对作物产量的影响。BADH基因已在多种植物中被证实调节植物对逆境胁迫的响应,但在大豆中的调控机制尚不清晰。本研究克隆了GmBADH1基因,qRT-PCR显示该基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达丰度最高。通过农杆菌介导的大豆遗传转化技术将CRISPR/Cas9系统构建的表达载体转入到大豆品种JACK中,产生了3种可以调控大豆耐盐性状的靶向突变,均发生在编码区,分别为缺失19 bp、插入1 bp、插入9bp替换2 bp。前两者,过早出现的终止密码子,使其均产生截断的BADH1蛋白,后者发生移码突变。在出苗期和苗期分别对突变纯合植株进行盐处理,结果表明,出苗期耐盐性与野生型相比显著下降,苗期与野生型相比无明显差异。这说明GmBADH1基因可能主要调控出苗期的耐盐性状。本研究为深入挖掘大豆耐盐基因和培育大豆耐盐品种提供了依据。

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

CRISPR/Cas9介导的adeG基因敲除大肠杆菌细菌模型的建立

【目的】鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是引起医院内感染的重要条件致病菌之一,耐药性AB是目前防治的棘手问题。细菌外排泵是引起耐药性的重要原因之一,拟通过PCR检测鲍曼不动杆菌耐药结节分化家族(resistance-nodulation-division,RND)外排泵基因adeLFGH的分布,探索其与耐药性的关系;建立adeG耐药基因模型,利用CRISPR/Cas9系统对其进行靶向敲除的初步研究。【方法】运用肉汤微量稀释法检测耐药性分布;PCR筛查13株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH外排泵基因并分析其分布;扩增RND外排泵关键基因adeG并构建耐药细菌模型;设计特异性sgRNA,利用CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除,药敏实验检测其敲除效果。【结果】13株临床鲍曼不动杆菌对多黏菌素E敏感,对左氧氟沙星耐药率较低,仅为38.5%,对头孢他啶的耐药率为92.3%,对妥布霉素耐药率为84.6%,对其他临床常见药物耐药率均为100%。13株多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH携带率为100%。药敏实验结果显示adeG模型耐药菌株的哌拉西林、替卡西林/克拉维酸以及哌拉西林/他唑巴坦由敏感转为耐药,氯霉素、美罗培南、米诺环素由敏感转为中介。特异性sgRNA介导CRISPR/Cas9系统靶向敲除效率不同。pCas9-sgRNA1(adeG)靶向后哌拉西林/他唑巴坦的耐药性得到了逆转,对妥布霉素、四环素、多西环素、米诺环素的耐药性也有不同程度的降低;pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)使哌拉西林/他唑巴坦由耐药恢复到了中介,但对其他药物的耐药性逆转效果并不显著。【结论】特异性CRISPR/Cas9系统可以特异性敲除耐药基因,提示可为耐药菌的治疗提供新的思路和方法。

利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。

CRISPR/Cas9系统在畜禽遗传改良中研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种高效的基因组编辑方法,在畜牧业遗传改良领域得到了广泛的应用。该技术以高效、精准的特点,为畜牧业发展带来了一场革命。目前,基于CRISPR/Cas9的基因敲除、基因敲入和基因修饰等已被广泛应用,实现了对畜禽物种的重要生产性状进行精准改良。本文介绍了CRISPR/Cas9技术的工作原理及发展历程,重点介绍了该技术在畜禽肌肉生长发育、绒毛纤维生长、乳品质成分、抗病育种以及动物福利中的研究进展,旨在为更深入地了解CRISPR/Cas9技术在畜禽基因编辑上的应用提供参考。

基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法

为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察。研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法。

CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(P<0.05)。应用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。

基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究

目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

CRISPR/Cas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展

食源性病原菌引起的食品安全事件引起广泛关注,为保证食品安全,采取有效的检测手段至关重要。新兴的簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统,可高效、特异性识别并切割外源核酸,与传统技术相比在检测病原菌方面更为高效。本文基于CRISPR/Cas生物传感系统-等温扩增技术联用的相关研究进行综述,对CRISPR/Cas系统的分类、原理以及与等温扩增耦合后在食源性病原菌检测方面的研究进展进行概述,并对其在即时检测应用中的前景以及所面临的挑战进行深入探讨,以期为CRISPR/Cas生物传感系统的进一步发展提供参考。

CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。

CRISPR-Cas13a系统在病原体检测应用中的最新研究进展

规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统已作为近年来兴起的新一代分子诊断工具,被广泛应用于基因编辑、核酸检测等领域,其中Cas13a亚型因其在核酸检测中高特异度、高灵敏度、无需昂贵设备、操作简单、费用低廉等特点,在病原体检测领域展现出巨大的潜力。该文综述了CRISPR-Cas13a的作用机制、在病原体检测中的应用以及相关检测方法,并对Cas13a应用前景进行了展望。以期为CRISPR-Cas13a系统的进一步研究及其在病原体检测中的应用提供借鉴和参考。