北京市售生食果蔬中耐药基因赋存特征及迁移风险

目的调研抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的赋存特征,探讨其在食品安全领域的潜在风险。方法采用高通量定量聚合酶链式反应(high-throughput quantitative polymerase chain reaction,HT-qPCR)技术,对北京市售生食果蔬中ARGs及可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)的多样性和存在丰度进行描述,并通过高风险筛查、相关性分析、冗余分析、方差分解分析,探讨ARGs的迁移风险。结果共检出9大类188个ARGs和9个MGEs,丰度范围分别为6.18×10^(3)~1.24×10^(8) copies/g、5.86×10^(3)~3.34×10^(8) copies/g;四环素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯-林可霉素-链阳霉素类(macrolide-lincosamide-streptogramin B,MLSB)ARGs分布最广;多重耐药类ARGs丰度最高;涉及的主要耐药机制贡献大小为抗生素灭活>外排泵>细胞保护。其中,苦菊的ARGs检出率最高,青椒的ARGs丰度最高;茄果类、叶菜类ARGs丰度普遍高于根茎类蔬菜;水果类样品中ARGs的检出率和丰度最低。高风险ARGs普遍存在,丰度最高可达7.85×10^(7) copies/g,且氨基糖苷类、磺胺类、四环素类、多重耐药类ARGs具有高迁移风险,整合酶和转座酶两类转移机制共同构成主要驱动因素(46.44%)。结论生食果蔬中ARGs赋存情况严重,具有较高的迁移风险,很可能导致耐药现象的大量产生及扩散,危害人类健康,应引起高度重视。

神经外科ICU耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染疑似暴发调查与控制

目的调查神经外科重症监护病房(ICU)耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)医院感染暴发原因,查找传染源及传播途径,为有效控制多重耐药菌医院感染提供依据。方法对某院2023年7月28日-8月2日神经外科ICU 3例CRKP感染患者进行流行病学调查,按照环境卫生监测方法采集标本,查找病房环境中的CRKP,分析CRKP菌株耐药性及携带的耐药基因,采用肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)及多位点序列分析(MLST)分析患者与环境监测分离CRKP菌株的同源性。结果共有3例CRKP医院感染,罹患率为3.85%(3/78),与2022年同期及2023年5-6月罹患率相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。环境卫生学监测显示,1床呼吸机接口、治疗台和9床被服检出CRKP,检出率为4.84%(3/62);15份医务人员手标本和3份神经外科ICU空气监测标本均未检出CRKP;环境卫生监测检出3株CRKP;其耐药性、耐药基因及同源性与患者临床标本分离的CRKP一致。在采取集中隔离,严格进行病房环境清洁和消毒,严格执行侵入性器械消毒和管理,加强医护人员分组诊疗,工作服消毒,以及手卫生等一系列针对性措施后,此次事件得到有效控制。结论此次事件可判定为一起疑似CRKP医院感染暴发事件,推测侵入性器械消毒管理不到位、患者住院环境消毒不彻底、医护人员未分组诊疗及手卫生不到位是本次疑似医院感染暴发的主要原因。早期识别感染暴发,调查传染源及传播途径,以及及时采取针对性措施是控制感染暴发的关键。

Specific primers design based on the superoxide dismutase b gene for Trypanosoma cruzi as a screening tool:Validation method using strains from Colombia classified according to their discrete typing unit

Objective:To classify 21 new isolates of Trypanosoma cruai(T.cruzi) according to the Discrete Typing Unit(DTU) which they belong to,as well as tune up a new pair of primers designed to detect the parasite in biological samples.Methods:Strains were isolated,DNA extracted,and classified by using three Polymerase Chain Reactions(PCR).Subsequently this DNA was used along with other isolates of various biological samples,for a new PCR using primers designed.Finally,the amplified fragments were sequenced.Results:It was observed the predominance of DTU i in Colombia,as well as the specificity of our primers for detection of T.cruzi,while no band was obtained when other species were used.Conclusions:This work reveals the genetic variability of 21 new isolates of T.cruzi in Colombia.Our primers confirmed their specificity for detecting the presence of T.cruzi.

PCR管内温度的精准预测及快速控温

聚合酶链式反应(PCR)分析仪以样品块(Block)温度为控制对象实现样本温度控制,易产生热滞效应。为减小管内迟滞,缩短样本的变温时间,该研究在利用有限元分析技术建立单孔样本热传导模型的基础上,构建一种融合初始温度-目标温度-等效热阻的三参数模型预测管内实际温度,实现PCR过程管内温度实时跟踪。根据模型精准预测管内温度,对样品块进行精准快速控温,大幅缩短升降温时间,降低了管内样品的传热迟滞。实验结果表明,与管内实际温度相比,管内样品温度预测方法误差低于±1.5℃;样品块温度控制目标曲线优化后,管内温度迟滞时间缩短了27%以上。该文提出精准控制温度过冲的优化方法在保证管内样本温度的基础上显著缩短了PCR热循环整体时间,有利于实现更快速、更精准的核酸定量检测结果。

一种分区温控的实时荧光PCR快速热循环系统设计

热循环系统是实时荧光聚合酶链式反应(PCR)仪的关键组成部分,决定了核酸检测效率和结果准确性.针对传统PCR检测系统的热循环耗费时间长、温度控制复杂的问题,设计了一种分区温控的实时荧光PCR热循环系统,包括热循环系统硬件电路和机械结构,通过控制试液在不同恒温区切换实现快速热循环,采用增量式比例积分微分算法控制恒温区温度,控制精度达到±0.1℃.使用Fluent建立传热模型,分析试液热延迟现象预估试液变化规律.通过搭建PCR样机进行实验验证,试液升降温速率分别为3.8和4.4℃/s,证明了所提出PCR热循环系统能有效提高检测效率.

湖南地区携带HLA-B*27꞉04等位基因人群与强直性脊柱炎的易感性具有强相关性

目的:人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)B27是强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)的易感等位基因,HLA-B27抗原分型是临床诊断AS的重要指标,但目前的分型方法如序列特异引物聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)等仍存在一定的缺陷。因此,本研究旨在应用高分辨率聚合酶链反应直接测序分型法(polymerase chain reaction-sequence-based typing,PCR-SBT)分析B27亚型与湖南地区强直性脊柱炎易感性的相关性。方法:收集2020年1至12月在湘雅二医院门诊就医的116例疑似AS患者(疑似AS组)和121名健康志愿者(对照组)的外周血,采用PCR-SBT进行HLA-B基因分型。在疑似AS组患者中,23名患者最终被确诊为AS(AS确诊组),其余的93名未能确诊的患者为非AS确诊组。采用PCR-SBT和PCR-SSP检测116例疑似AS患者的HLA-B27分型,并比较2种方法的检测结果。结果:疑似AS组HLA-B27等位基因频率显著高于对照组[11.63%vs 2.48%;P<0.001,优势比(odds ratio,OR)=5.18,95%置信区间(confidence interval,CI)2.097~12.795]。疑似AS组和对照组均检出B*27:04、B*27:05、B*27:06、B*27:07。疑似AS组B*27:04等位基因频率明显高于对照组[9.48%vs 1.24%;P<0.001,OR=8.346,95%CI 2.463~28.282]。疑似AS组和AS确诊组B27阳性率(B27+/+和B27+/-)均显著高于对照组(分别χ^(2)=16.579,P<0.001;χ^(2)=94.582,P<0.001)。在AS确诊组中,21例为HLA-B27携带者,AS确诊组B27阳性率为91.3%。PCR-SBT方法可对HLA-B基因位点进行高分辨分型,其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度均高于PCR-SSP法。结论:应用PCR-SBT检测出HLA-B*27:04与湖南地区AS具有强相关性。PCR-SBT可作为临床AS辅助诊断的优选方案。

嗜热菌是怎样炼成的

在遥远的细菌古国,突然降临的高温无情地夺走了细菌们的生命。危难当前,细菌国王修炼起“嗜热神功”来提高细胞膜和蛋白质的耐高温性,并率领族人登上“诺亚方舟”以实现繁衍生息。细菌们在适应高温的同时也爱上了高温,成为了“嗜热菌”。通过与人类科学家的合作,嗜热菌们在工业生产等领域发挥了巨大作用,发现了实现自我价值的“新大陆”。

土壤碳氮磷硫循环对温度的响应

温度是影响土壤中微生物介导的元素生物地球化学循环的重要因素。以广东省茂名市的稻田土壤为研究对象,利用高通量功能基因芯片对71种土壤元素循环相关的功能基因丰度进行测定并结合温度和培养时间等因子,研究了水稻土中微生物介导的碳、氮、磷、硫循环对温度的响应。结果表明:在检测的71种碳、氮、磷、硫相关基因中,63%的功能基因的丰度在35℃的培养温度中显著升高,并且这种趋势伴随培养时间的增加而显著增加。其中氮循环中的氨氧化过程中的amoA基因对温度的响应最为明显,响应比分别为35℃/15℃的(12.79±1.82)和35℃/25℃的(8.44±1.79)。揭示了土壤碳氮磷硫循环关键功能基因丰度对温度的响应特征,也为温度变化引起土壤微生物元素化学循环变化趋势的理论研究提供了基础。

一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

重复片段引物PCR用于鲍曼不动杆菌分型研究

目的 运用重复片段引物PCR的分析方法对鲍曼不动杆菌进行分子分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的的重复序列 (ERIC)为引物进行PCR扩增 ,对 2 2株鲍曼不动杆菌进行分型研究 ,并与生物学分型及抗生素耐药结果进行比较。结果 经重复片段引物PCR的方法 ,分离出 6种不同基因型的鲍曼不动杆菌 ,而生物学分型只有 2种 ,且与抗生素谱较为相关。结论 该方法简便易行 ,且重复性好 ,适合于医院感染流行病学研究。

耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床分离株的流行病学与耐药机制研究

目的了解耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌流行病学情况以及耐药机制,帮助临床合理使用抗菌药物,为控制医院感染提供依据。方法收集耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌110株及敏感株6株,进行来源病区和标本种类的统计分析;应用重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)进行基因型分型;使用PCR检测β-内酰胺酶基因(OXA、IMP、VIM等)及外排泵编码基因(ade A、ade B、ade C、ade J、ade G)的携带情况;采用实时荧光定量PCR对比耐药菌株与敏感菌株的外排泵基因表达量的差异。结果 110株菌株主要来自痰标本,重症监护病房(ICU)分离率最高;所有菌株REP-PCR电泳图谱分为A^G 7型,110株耐药菌株均为A型,且均被检测到含有OXA-23、OXA-51基因,均未检测到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因;外排泵编码基因ade A、ade B、ade C、ade J及ade G的阳性率均为100%;耐药菌株外排泵编码基因ade A、ade B、ade C表达量明显高于敏感菌株。结论耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的流行型别基本相同,均为A型,应引起临床医护人员的高度重视;β-内酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表达以及外排泵基因(ade A、ade B、ade C)的过度表达与其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性有关。

医院感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的SCCmec分型及同源性研究

目的研究多重耐药的甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）菌株的SCCmec基因分型,并对菌株进行同源性分析。方法纳入26株耐药谱相同的MRSA菌株,采用多重PCR检测SCCmec的分型;应用Rep-PCR法采用DiversiLb系统对菌株进行同源性分析。结果 26株MRSA的SCmec多数为Ⅲ型,占84.6%,另检出Ⅱ型2株、Ⅳ型1株,1株未能分型;未发现I型SCCmec。DiversiLab分析结果显示MRSA可分为10组,同源性介于40%～100%。其中SCCmee-Ⅱ亚型2株完全相同。SCCmec-Ⅲ亚型subtype 1型相似性在90%以上;subtype 3型4株为同一组、MRSA相似性在95%以上;subtype 2型可分为5组,相似性在90%以上。结论医院感染多重耐药的MRSA多数以SCCmec-Ⅲ型为主,医院内存在一定流行,应引起临床医师及感染控制部门重视。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

轮状病毒感染与健康儿童肠道菌群结构的比较

目的比较轮状病毒(RV)感染与健康儿童肠道菌群结构的差异,为临床治疗提供有价值的参考依据。方法采集20例RV感染及6例健康儿童粪便样品,提取粪便样品中细菌的混合DNA,先通过肠道菌重复性基因内一致性序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)结合分子杂交技术分析两组儿童之间肠道微生物组成的相似性;再扩增粪便样品中菌群的16 S rDNA基因V3区,利用PCR-TGGE技术分析肠道菌群的组成情况,研究两组儿童肠道微生物菌群组成的差异。结果肠道菌群的组成有很强的宿主专一性。RV感染与健康儿童相比,肠道菌群中糖皮质激素(GC)水平较低的细菌明显减少。微生态制剂治疗组温度梯度凝胶电泳(TGGE)条带数有一个逐渐增加的过程。结论轮状病毒感染时,可致患儿肠道菌群紊乱,但用抗生素治疗将更致肠道微生态失调,不利于患儿肠道菌群恢复,建议临床医师在轮状病毒感染时,慎用抗生素。

鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REP-PCR分析

为探讨鸡产气荚膜梭菌流行现状的调查方法,采用REP-PCR(repetitive extragenic palindromicPCR)技术对四川省10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行了遗传多样性分析,并与AFLP(amplified fragment length polymorphism)方法进行了分型比较。结果显示,尽管REP-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型,但是,仍然表现出对产气荚膜梭菌菌株的较高的鉴别能力,不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法。经对亚型分布情况进行分析,表明产气荚膜梭菌的流行特点与地区差异相关,不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显,而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型为REP-PCR基因1型、2型和3型。证实,REP-PCR技术适用于鸡产气荚膜梭菌遗传多样性分析。

番茄Mi-1基因的SNP分型

SNP分型是SNP分子标记辅助育种,以及分子遗传作图等研究的重要基础技术。试验利用在番茄Mi-1基因中开发出的一个A/T型SNP位点,应用等位基因聚合酶链式反应技术,成功的对438个F2群体进行了SNP分型。结果表明,这一F2群体中有72个纯合T/T基因型,175个杂合A/T基因型,70个纯合A/A基因型,以及121个不明原因缺失的F2单株,已得基因型经卡方测验符合1:2:1分离比例;同时,试验通过在下游引物3′末端第二、三位点引入错配碱基,以及优化PCR反应体系为Mg2+1.875 mmol.L-1,dNTP 100μmol.L-1,提高了反应的准确性,为番茄抗根结线虫辅助育种打下了基础。

羊羔美酒大曲中乳酸菌多样性及分子鉴定

目的:分离和鉴定羊羔美酒大曲中的乳酸菌,探寻其菌群多样性,为酿酒工艺条件改进提供参考。方法:将酒曲进行梯度稀释、富集培养、平板画线等分离纯化,获取乳酸菌单菌落。采用菌落特征和个体形态特征结合的方法进行乳酸菌形态鉴定。乳酸菌的分子鉴定采用重复序列聚合酶链式反应(repetitive sequence-based polymerase chain reaction,Rep-PCR)技术和16S r DNA序列分析法。结果:从羊羔美酒大曲中共得到65株乳酸菌,形态学分为9类。用Rep-PCR技术在75%的相似性上将其区分为5类,经基因序列分析,鉴定为分属于4个属的乳酸菌,分别为:片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)。结论:传统微生物分离技术与现代分子鉴定技术相结合,可快速准确鉴定出羊羔美酒大曲中乳酸菌的菌群组成和多样性。

重复序列引物聚合酶链反应追踪金黄色葡萄球菌所致医院感染

目的利用重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)追踪我院一起由金葡菌所致的医院感染。方法分离得到的50株金葡菌用PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定,苯唑西林-盐琼脂筛选MRSA表型；PCR检测其耐药基因mecA；rep- PCR作金葡菌基因分型。结果50株金葡菌中,22株mecA阳性,其中19株分离自患者标本。采用rep-PCR,50株金葡菌均出现9～11条带的电泳图谱,从而可分成11个不同的基因型。结论rep-PCR是一种快速、简便、可靠的基因分型方法,是在分子水平追踪医院感染病原菌较理想的工具。

一种5重real-time PCR筛查转基因水稻方法的建立

以转基因水稻中最常用的CaMV35S启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS水稻内标基因为研究对象,利用5种不同的荧光信号(FAM、HEX、Taxas Red、Cy5、Cy5.5)进行多重实时聚合酶链式反应(realtime polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法的研究。通过引物组合筛选、反应体系优化、特异性测试、灵敏度测试、适用性测试等一系列实验,建立了5重real-time PCR方法,灵敏度可达0.032%。此方法具有灵敏度高、结果准确、通量大等优点,可实现水稻中转基因成分的快速、高效检测。

ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估

目的了解仁济医院鲍曼不动杆菌的基因同源性,验证肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)在鲍曼不动杆菌基因分型中的实用性。方法采用琼脂稀释法检测临床分离的81株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用ERIC-PCR对81株鲍曼不动杆菌进行基因分型;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中的43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进一步分型,以PFGE分型为参考标准,验证ERIC-PCR在基因分型中的实用性。结果 81株鲍曼不动杆菌对临床常用的13种抗菌药物普遍耐药,只对米诺环素耐药率最低,为30.9%,其次是亚胺培南,为53.1%,对其他抗菌药物的耐药率均>60%。81株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR分型主要为A、B、C、D、E、F 6型,其中A、B、C型为主要的流行株。43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分型为A型41株(A1型29株,A2型12株)、B型1株、C型1株。PFGE分型将其分为5型,A型34株(A1型31株,A2型3株),B型6株,C、D、E分型各1株。结论仁济医院鲍曼不动杆菌存在克隆播散,且主要为耐亚胺培南鲍曼不动杆菌。ERIC-PCR分辨力较强,结果可靠,与PFGE结果具有一定的相关性,是一种简便、快捷的基因分型技术。