一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

重复片段引物PCR用于鲍曼不动杆菌分型研究

目的 运用重复片段引物PCR的分析方法对鲍曼不动杆菌进行分子分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的的重复序列 (ERIC)为引物进行PCR扩增 ,对 2 2株鲍曼不动杆菌进行分型研究 ,并与生物学分型及抗生素耐药结果进行比较。结果 经重复片段引物PCR的方法 ,分离出 6种不同基因型的鲍曼不动杆菌 ,而生物学分型只有 2种 ,且与抗生素谱较为相关。结论 该方法简便易行 ,且重复性好 ,适合于医院感染流行病学研究。

耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床分离株的流行病学与耐药机制研究

目的了解耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌流行病学情况以及耐药机制,帮助临床合理使用抗菌药物,为控制医院感染提供依据。方法收集耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌110株及敏感株6株,进行来源病区和标本种类的统计分析;应用重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)进行基因型分型;使用PCR检测β-内酰胺酶基因(OXA、IMP、VIM等)及外排泵编码基因(ade A、ade B、ade C、ade J、ade G)的携带情况;采用实时荧光定量PCR对比耐药菌株与敏感菌株的外排泵基因表达量的差异。结果 110株菌株主要来自痰标本,重症监护病房(ICU)分离率最高;所有菌株REP-PCR电泳图谱分为A^G 7型,110株耐药菌株均为A型,且均被检测到含有OXA-23、OXA-51基因,均未检测到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因;外排泵编码基因ade A、ade B、ade C、ade J及ade G的阳性率均为100%;耐药菌株外排泵编码基因ade A、ade B、ade C表达量明显高于敏感菌株。结论耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的流行型别基本相同,均为A型,应引起临床医护人员的高度重视;β-内酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表达以及外排泵基因(ade A、ade B、ade C)的过度表达与其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性有关。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

医院感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的SCCmec分型及同源性研究

目的研究多重耐药的甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）菌株的SCCmec基因分型,并对菌株进行同源性分析。方法纳入26株耐药谱相同的MRSA菌株,采用多重PCR检测SCCmec的分型;应用Rep-PCR法采用DiversiLb系统对菌株进行同源性分析。结果 26株MRSA的SCmec多数为Ⅲ型,占84.6%,另检出Ⅱ型2株、Ⅳ型1株,1株未能分型;未发现I型SCCmec。DiversiLab分析结果显示MRSA可分为10组,同源性介于40%～100%。其中SCCmee-Ⅱ亚型2株完全相同。SCCmec-Ⅲ亚型subtype 1型相似性在90%以上;subtype 3型4株为同一组、MRSA相似性在95%以上;subtype 2型可分为5组,相似性在90%以上。结论医院感染多重耐药的MRSA多数以SCCmec-Ⅲ型为主,医院内存在一定流行,应引起临床医师及感染控制部门重视。

轮状病毒感染与健康儿童肠道菌群结构的比较

目的比较轮状病毒(RV)感染与健康儿童肠道菌群结构的差异,为临床治疗提供有价值的参考依据。方法采集20例RV感染及6例健康儿童粪便样品,提取粪便样品中细菌的混合DNA,先通过肠道菌重复性基因内一致性序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)结合分子杂交技术分析两组儿童之间肠道微生物组成的相似性;再扩增粪便样品中菌群的16 S rDNA基因V3区,利用PCR-TGGE技术分析肠道菌群的组成情况,研究两组儿童肠道微生物菌群组成的差异。结果肠道菌群的组成有很强的宿主专一性。RV感染与健康儿童相比,肠道菌群中糖皮质激素(GC)水平较低的细菌明显减少。微生态制剂治疗组温度梯度凝胶电泳(TGGE)条带数有一个逐渐增加的过程。结论轮状病毒感染时,可致患儿肠道菌群紊乱,但用抗生素治疗将更致肠道微生态失调,不利于患儿肠道菌群恢复,建议临床医师在轮状病毒感染时,慎用抗生素。

鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REP-PCR分析

为探讨鸡产气荚膜梭菌流行现状的调查方法,采用REP-PCR(repetitive extragenic palindromicPCR)技术对四川省10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行了遗传多样性分析,并与AFLP(amplified fragment length polymorphism)方法进行了分型比较。结果显示,尽管REP-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型,但是,仍然表现出对产气荚膜梭菌菌株的较高的鉴别能力,不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法。经对亚型分布情况进行分析,表明产气荚膜梭菌的流行特点与地区差异相关,不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显,而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型为REP-PCR基因1型、2型和3型。证实,REP-PCR技术适用于鸡产气荚膜梭菌遗传多样性分析。

ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估

目的了解仁济医院鲍曼不动杆菌的基因同源性,验证肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)在鲍曼不动杆菌基因分型中的实用性。方法采用琼脂稀释法检测临床分离的81株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用ERIC-PCR对81株鲍曼不动杆菌进行基因分型;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中的43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进一步分型,以PFGE分型为参考标准,验证ERIC-PCR在基因分型中的实用性。结果 81株鲍曼不动杆菌对临床常用的13种抗菌药物普遍耐药,只对米诺环素耐药率最低,为30.9%,其次是亚胺培南,为53.1%,对其他抗菌药物的耐药率均>60%。81株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR分型主要为A、B、C、D、E、F 6型,其中A、B、C型为主要的流行株。43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分型为A型41株(A1型29株,A2型12株)、B型1株、C型1株。PFGE分型将其分为5型,A型34株(A1型31株,A2型3株),B型6株,C、D、E分型各1株。结论仁济医院鲍曼不动杆菌存在克隆播散,且主要为耐亚胺培南鲍曼不动杆菌。ERIC-PCR分辨力较强,结果可靠,与PFGE结果具有一定的相关性,是一种简便、快捷的基因分型技术。

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌ERIC-PCR指纹图谱分型的研究

目的探究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(KPC)的ERIC-PCR指纹图谱分型。方法收集成都中医药大学2016年7月—2017年4月临床标本中分离出的KPC31株,行药敏试验、改良Hodge试验,并采用PCR检测碳青霉烯酶基因;阳性结果行DNA测序,并与BLAST比对确定基因型,以肠杆菌科基因间重复序列(ERIC-PCR)行同源性分析。结果31株KPC主要来源于重症监护室;所测KPC菌株对β-内酰胺类药物100%耐药,仅部分菌株对四环素、庆大霉素、阿米卡星、复方新诺明表现敏感,敏感率分别为3.23%、9.68%、90.32%、67.74%;改良Hodge试验显示29株KPC均为阳性;DNA测序及PCR扩增证实bla_(KPC-2)基因型30株;bla_(IMP-1)基因型1株;ERIC-PCR同源性分析发现KPCA1型30株及A2型1株。结论bla_(KPC-2)是导致KPC产生的主要分型,且A1型已在我院流行,应引起临床重视,加强院感监控及预防。ERIC-PCR是一种适合于做同源性分型筛查的简便快捷的初步基因分型技术。

REP-PCR分型法用于白假丝酵母菌群分析

目的运用Agilent生物分析仪对临床白假丝酵母菌进行重复序列(REP)-聚合酶链反应(PCR)分型,并分析其流行趋势。方法设计REP引物,进行PCR扩增,用DL7500 Labchip芯片在Agilent 2100生物分析仪上对产物做微流电泳,获得虚拟凝胶视图,再运用GelCompareⅡ软件对其DNA指纹图谱做聚类分析。结果白假丝酵母菌菌株指纹图谱相似度较高,>80%以上。被分析的100株临床株可分为9个基因型。结论REP-PCR的Agilent 2100同源性分析具有快速、易于操作、高重复性和高分辨率等优点,可广泛用于流行病学调查与研究。

医院环境中物体表面碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌污染及同源性分析

目的调查某院重点部门物体表面碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌污染情况及其同源性。方法对该院重症监护室(ICU)、急诊重症监护室(EICU)、血液透析室、手术室进行环境卫生学监测,采用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR),对ICU、EICU环境中污染的条件致病菌鲍曼不动杆菌进行扩增分型。结果除EICU医务人员手卫生结果达标外,ICU及EICU各检测项目细菌计数均不达标;血液透析室及手术室采样标本均合格。ICU、EICU物体表面共采集标本53份,检出鲍曼不动杆菌7株,检出率为13.21%;此7株菌均为碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌,其中6株基因型相同,与患者痰中分离的鲍曼不动杆菌基因型相同。结论该院重点部门环境中物体表面分离的碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌具有同源性,应加强其环境物体表面清洁与消毒,降低医院感染的发生。

重复序列引物聚合酶链反应追踪金黄色葡萄球菌所致医院感染

目的利用重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)追踪我院一起由金葡菌所致的医院感染。方法分离得到的50株金葡菌用PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定,苯唑西林-盐琼脂筛选MRSA表型；PCR检测其耐药基因mecA；rep- PCR作金葡菌基因分型。结果50株金葡菌中,22株mecA阳性,其中19株分离自患者标本。采用rep-PCR,50株金葡菌均出现9～11条带的电泳图谱,从而可分成11个不同的基因型。结论rep-PCR是一种快速、简便、可靠的基因分型方法,是在分子水平追踪医院感染病原菌较理想的工具。

羊羔美酒大曲中乳酸菌多样性及分子鉴定

目的:分离和鉴定羊羔美酒大曲中的乳酸菌,探寻其菌群多样性,为酿酒工艺条件改进提供参考。方法:将酒曲进行梯度稀释、富集培养、平板画线等分离纯化,获取乳酸菌单菌落。采用菌落特征和个体形态特征结合的方法进行乳酸菌形态鉴定。乳酸菌的分子鉴定采用重复序列聚合酶链式反应(repetitive sequence-based polymerase chain reaction,Rep-PCR)技术和16S r DNA序列分析法。结果:从羊羔美酒大曲中共得到65株乳酸菌,形态学分为9类。用Rep-PCR技术在75%的相似性上将其区分为5类,经基因序列分析,鉴定为分属于4个属的乳酸菌,分别为:片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)。结论:传统微生物分离技术与现代分子鉴定技术相结合,可快速准确鉴定出羊羔美酒大曲中乳酸菌的菌群组成和多样性。

碳青霉烯类耐药大肠埃希菌耐药基因型检测及同源性分析

目的检测临床分离碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的耐药基因型,并对其同源性进行分析,研究其流行情况。方法收集铜陵市人民医院2012年9月至2016年10月临床分离碳青霉烯类耐药大肠埃希菌,采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型,EDTA双纸片协同试验进行金属酶初筛,聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因(bla KPC、bla IMP、bla VIM、bla NDM和bla OXA-48),并对阳性扩增产物进行基因测序;同源性分析采用肠杆菌科基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(ERIC-PCR)。结果共收集碳青霉烯类耐药大肠埃希菌25株,8株改良Hodge试验阳性,13株金属酶初筛试验阳性,其中4株携带bla NDM-1基因,1株携带bla IMP-4基因,1株携带bla KPC-2基因;ERIC-PCR检测分为10种型别。结论碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的耐药机制主要是产金属酶,携带NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌需重点监测;碳青霉烯类耐药大肠埃希菌未在医院引起克隆流行。

老年人根面菌斑内氏放线菌临床分离株基因型多样性分析

目的分析老年人根面菌斑中内氏放线菌临床株的基因型多样性,探讨内氏放线菌基因型与根面龋的关系。方法选择老年根面龋患者20例设为根面龋组,无根面龋老年人20例设为无龋组。根面龋组以暴露的无龋根面和根面龋损部位为取样位点,无龋组以暴露的根面为取样位点,刮取菌斑进行临床株的分离鉴定,并利用基因外重复回文序列聚合酶链反应(REP-PCR)分析内氏放线菌基因型的多样性。结果 2组共分离出内氏放线菌299株,选择156株进行REP-PCR分析,分离出61个不同的基因型。根面龋组无龋根面分离的57株内氏放线菌有25个基因型,根面龋损部位分离的34株有25个基因型,无龋组分离的65株有26个基因型:内氏放线菌基因型存在多样性。单个取样位点的基因型数目存在差异(P<0.05)。结论多种基因型的内氏放线菌参与了根面龋的发生。

重复序列PCR与多位点分型技术在白假丝酵母菌基因分型中的比较

目的应用多位点序列分型技术(MLST)和重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)对临床分离出的白假丝酵母菌进行分型,并对两种方法作出应用评价。方法收集上海地区医院中真菌性阴道炎分离出的40株白假丝酵母菌,选择合适引物进行扩增,通过电泳比较分析获得REP-PCR分型。选择7对管家基因进行PCR反应并测序,将测序结果与标准序列进行比对,获得由7对管家基因组成的等位基因谱,最终得到相应的序列分型。结果 REP-PCR中Ca22-Ca22引物对得到电泳条带最优,40株白假丝酵母菌共分成7种REP-PCR型;MLST分型得出29种,且均为新型。结论 MLST分辨率较REP-PCR高,但由于REP-PCR分型方法更为快捷、经济,更适用于实验室大量菌株分型和临床分型。MLST则更客观,更适合用于进化学的研究及全球性流行病学的调查研究。

耐阿米卡星铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药基因及其基因型研究

目的了解耐阿米卡星(AMK)铜绿假单胞菌(Pa)的氨基糖苷类修饰酶基因和氨基糖苷耐药基因的存在情况及其基因型。方法对临床分离的72株多重耐药Pa(其中对AMK耐药Pa组和对AMK敏感Pa组各36株)分别用聚合酶链反应(PCR)测定9种主要的氨基糖苷类修饰酶基因和2种氨基糖苷耐药基因,用基因外重复回文序列(REP)-PCR进行基因型研究。结果在分组研究中AMK耐药Pa组表现为aac(6′)-Ⅰ和aac(3)-Ⅱ基因同时阳性的占42.4%,aac(6′)-Ⅰ和ant(2″)-Ⅰ基因同时阳性的占36.4%,是耐药组的主要修饰酶基因;AMK敏感Pa组表现为aac(6′)-Ⅰ基因阳性的占50.0%,aac(3)-Ⅱ基因阳性的占33.2%,是敏感组的主要修饰酶基因。2种氨基糖苷耐药基因(RmtA和RmtD)均为阴性。REP-PCR显示耐药菌株可分为A～G 7型,其中AMK耐药Pa组的主要分型为F型(其中尤以F1型为多);AMK敏感Pa组以E型为多见。结论通过2种或多种氨基糖苷类修饰酶同时作用于AMK是Pa对AMK耐药的重要途径之一。

埃及血吸虫基因组内存在着曼氏血吸虫基因组“特异的”DNA重复序列

目的 探索埃及血吸虫基因组内是否存在曼氏血吸虫基因组“特异的”高度重复序列Sm1- 7。方法 以埃及血吸虫基因组 DNA为模板 ,用根据 Sm1- 7设计并合成的寡核苷酸引物进行多聚酶链式反应 (PCR)扩增 ,选取扩增产物中长约 30 0 bp的 DNA片段 ,经过预处理后与去磷酸化的质粒载体 p Bluescript (KS+)进行连接 ,连接产物转化至大肠杆菌 JM10 9。重组质粒经纯化后作DNA序列测定。结果 从埃及血吸虫基因组 DNA中成功地扩增出与曼氏血吸虫基因组重复序列Sm1- 7同源的重复序列。通过 DNA序列测定显示 ,除个别碱基不同外 ,从埃及血吸虫基因组获得的重复序列与曼氏血吸虫基因组重复序列 Sm1- 7完全相同。灵敏度分析显示该重复序列在埃及血吸虫基因组内的拷贝数远低于其在曼氏血吸虫基因组内的拷贝数。结论 曼氏血吸虫基因组“特异的”DNA重复序列 Sm1-

重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较

目的分析比较重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)与多位点分型技术(MLST)在热带假丝酵母菌基因分型中的应用。方法收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌,分别以Ca-21、Ca-22、Com-21两两组合为引物,选用最合适的引物对进行REP-PCR后通过电泳获得REP-PCR型。在不同型别中各挑选3株采用MLST法扩增热带假丝酵母菌的6个管家基因,扩增片段测序后与数据库比对得到相应的序列型(sequencetype,ST)。结果 REP-PCR以Com21-Com21为引物对分型效果最好,REP-PCR与MLST分型结果一致。147株热带假丝酵母菌产生A～H共8种REP-PCR型,分别对应MLST的ST146、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和ST117。结论 REP-PCR与MLST在热带假丝酵母菌的基因分型中分辨率相同,而REP-PCR更为方便迅速,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。

恶性疟原虫疫苗的研究──Ⅰ．环子孢子蛋白基因中央保守区的体外扩增

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因中央保守区编码产物具有３７个ＮＡＮＰ串联重复序列，并认为（ＮＡＮＰ）ｎ具有保护性免疫作用。本文通过酚／氯仿抽提乙醇沉淀方法提取恶性疟原虫全基因组ＤＮＡ，首次采用ＰＣＲ方法获得环子孢子蛋白ＣＳＰ基因中央保守区片段。我们用地高辛标记的ＰＣＲ产物作ＤＮＡ探针，杂交试验表明具有高度的敏感性和特异性。同时，本文还探讨了ＰＣＲ技术在病原学检测、疫苗研制、流行病学调查、疗效考核等方面的潜在应用前景。