A protective human antibody against respiratory syncytial virus by targeting a prefusion epitope across sites IV and V of the viral fusion glycoprotein

Respiratory syncytial virus(RSV)is one of the leading pathogens that cause lower respiratory tract infections in infants and the elderly.Passive immunoprophylaxis with monoclonal antibody(mAb)has been approved to prevent morbidity and mortality from RSV infection in infants.Here we report the isolation of two neutralizing mAbs against RSV from convalescent children by prefusion form of fusion(F)glycoprotein as bait.One mAb RV11 exhibited good potency in neutralization of RSV strains from both A and B subtypes in cell-based assay,and protected mice from RSV infection in vivo.An RV11 escape mutant was identified,which contains an S443P mutation in F protein.Crystal structure showed the RV11 bound to a conserved prefusion epitope across the antigenic sites IV and V of the F glycoprotein.RV11 showed a strong synergistic effect when combined with two RSV antivirals,an F-targeting small molecular inhibitor ziresovir and a siteØneutralizing mAb D25(the parental mAb for nirsevimab).The study extended our knowledge to the neutralizing and protective epitopes of RSV,and the mAb RV11 deserves further development for clinical translation.

人呼吸道合胞病毒感染的预防和治疗研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)会引起呼吸道和肺部感染,尤其是婴幼儿和老人,容易出现严重感染。尽管RSV感染对医疗保健产生了全球性影响,目前仍以支持性的治疗为主。在过去的几十年中,随着对RSV发病机制和免疫病理学的了解不断加深,RSV的预防策略取得了重大进步。自1966年RSV疫苗首次试验以来已经过去50多年,目前有两种RSV疫苗获批上市。综述了当前RSV感染的治疗方案(包括RSV特异性和非特异性)以及RSV疫苗的研发进展,以期为RSV的治疗及疫苗的研发提供参考。

婴幼儿重点呼吸道病毒感染性疾病预防指南

呼吸道病毒是婴幼儿群体中常见的感染性病原体,其所导致的发病和死亡给家庭和社会造成巨大的疾病负担。一般性预防措施和疫苗、单克隆抗体等特异性预防手段的结合,能有效阻止呼吸道病毒传播,降低婴幼儿的患病风险。目前,公众对婴幼儿等弱势群体呼吸道疾病预防的关注度日益提高。国家卫生健康委妇幼健康中心、中华预防医学会儿童保健分会组织专家制定本指南,旨在增强各级医疗卫生机构医务人员对婴幼儿呼吸道病毒感染性疾病的预防意识和专业技能,促进其积极采取综合防控措施,推广有效的创新技术和预防手段,以实现对婴幼儿广泛、高效和长期的保护,提升儿童远期健康水平。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800~1∶25600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47~57 aa、57~67 aa及67~77 aa区域,其中57~67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。

我国呼吸道合胞病毒抗原亚型的初步探讨

呼吸道合胞病毒(RSV)作为婴幼儿下呼吸道感染的重要病原,早在20多年前已被证实,其分离株之间存在细微的抗原差异。随着特异的单克隆抗体(MAbs)的应用,人们在发现 RS病毒不同分离株之间主要结构蛋白组分上存在抗原变异性的同时,根据不同 RS 病毒分离株与MAbs 的反应性而将 RS 病毒分成 A、B 两个亚型。这两个抗原亚型不仅在人群中相互循环着出现。

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒疫苗株之间抗原差异的单克隆抗体分析

采用间接免疫荧光方法,用19株抗猪瘟病毒单克隆抗体对猪瘟病毒石门株与疫苗株(兔化弱毒株)的抗原性进行分析。结果显示,9株抗猪瘟病毒E2蛋白的单抗中有4株与2株病毒均反应,但反应程度略有差别;9株抗猪瘟病毒Erns蛋白的单抗中只有3株与2株病毒都反应,其他6株在识别石门株与兔化弱毒株之间存在差别;抗猪瘟病毒NS2/3蛋白的单抗只识别弱毒株。表明,抗猪瘟病毒单抗可用于猪瘟病毒石门株与兔化弱毒疫苗株抗原性差异的分析。

SARS-CoV单克隆抗体的制备及抗原表位的初步鉴定

参照已发表的SARS冠状病毒BJ0 1株基因序列 ,利用计算机软件预测并选取该病毒S、M、N三种主要结构蛋白部分抗原性优势区域 ,以编码Gly- Pro- Gly序列相连接合成两段嵌合基因A和B。并分别克隆于pGEX -6p- 1载体上用IPTG进行诱导表达 ,以纯化的嵌合蛋白A和B为抗原 ,分别免疫BALB c小鼠制备单克隆抗体。利用单克隆抗体亚型检测试剂盒和SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒对其进行亚型和特异性鉴定。结果表明融合表达两段嵌合基因产物 ,其大小分别为 34kD和35kD ,Westernblot分析证实两种表达产物都能被SARS病人康复期血清所识别。获得了 6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞克隆株。亚型鉴定结果除D3C5为IgG2a外其他单抗均为IgG1,而且所有单抗的轻链均为κ链。特异性鉴定发现除D3D1外 ,其余的 5株单抗均能与SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒发生特异性反应。将D3D1与灭活后经超声波裂解的SARS CoV进行Westernblot分析 ,发现它能特异性识别 180kD的蛋白带。分别融合表达了 6个S蛋白的寡肽 (S1- S6 ) ,并对筛选出的单克隆抗体相对应的抗原表位进行了初步鉴定。结果发现单克隆抗体D3D1特异性识别S2基因表达产物 (S蛋白的 4 4 7 4 5 8aa) ,D3C5特异性识别S5基因表达产物 (S蛋白的 789 799aa)。

牛呼吸道合胞体病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。方法以重组纯化的BRSV-G蛋白免疫家兔和小鼠,制备抗G蛋白的多克隆抗体(PcAb)和单克隆抗体(MAb),方阵滴定法优化DAS-ELISA方法抗体工作浓度及反应条件,并对其敏感性、特异性、符合率进行验证。结果获得5株稳定分泌抗G蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分泌抗体亚类均为IgG1型κ链,Western blot、IFA试验表明PcAb和MAb均与G蛋白和BRSV发生特异性反应,MAb作为捕获抗体的最佳包被浓度为2.5μg/mL,PcAb作为检测抗体最佳工作浓度为5μg/mL,判定临界值为0.22,最低检测限为1.43μg/mL,批内和批间重复性试验变异系数均小于10%,与常引起牛呼吸道疾病的几种病原均无交叉反应,与RT-PCR的敏感性、特异性、符合率分别为92.0%、100%、95.6%。结论建立的检测BRSV的DAS-ELISA方法可用于临床样品的大规模检测,为BRSV疫情的监测和快速诊断奠定了基础。

抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体的制备及其对RSV病毒株抗原性的分析

用呼吸道合胞病毒R6(武汉地方株)活毒滴鼻加用戍二醛固定的病毒感染的Hela细胞免疫BALB/C鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP_2/0细胞融合,培育出分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞13株,这些细胞的染色体数为94至104条,其分泌的抗体分别属于鼠IgC_1、IgG_(2a)、IgG_(2b)亚类。腹水荧光抗体滴度为1:10000～1:100000。其中五株单抗有中和病毒作用,尤其是两株中和放价达1:128。应用免疫转印法证实了这些单抗分别能识别RSV6种主要结构蛋白,用7株识别不同病毒结构蛋白的单抗对12株合胞病毒进行抗原性分析,可将这些病毒区分为二个血清型,即A亚型和B亚型。

北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达

为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒（HRSV）N蛋白基因的特征，并用大肠杆菌表达获得N蛋白，从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株（3株A亚型，4株B亚型），分别经RTPCR扩增得到HRSVN蛋白全基因，克隆至pUCm—T载体中并进行测序和分析；从重组质粒pUCm—N9968中经PCR扩增获得N基因，亚克隆人原核表达载体pET30a（＋）中，得到重组表达质粒pET30a—N9968，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导培养；SDS-PAGE和Westernblot检测目的蛋白的表达和抗原性。经扩增并测序，7株HRSVN蛋白基因全长均为1176bp，编码一个含391个氨基酸的蛋白；北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85．4％～99．7％之间和95．4％～100％之间，进一步证明N蛋白基因的高度保守性。经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白，主要以包涵体形式存在。N蛋白粗提物经Ni^2＋亲和层析获得较理想纯化。Westernblot结果显示，所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应。说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达，并且具有特异的抗原活性，为今后进一步研究奠定了基础。

呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的:建立能稳定分泌抗呼吸道合胞病毒(RSV-long株,国际标准株)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法:杂交瘤技术制备单抗,鉴定各项特性。结果:培育出稳定分泌抗RSV蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞5株。杂交瘤细胞株染色体数目在89～104条之间,其分泌的抗体分别属于鼠IgG1、IgG2a、IgG2b亚类,各种腹水单抗的荧光效价在1∶4000～1∶16000之间。一种单抗识别RSV基质蛋白(M),两种单抗识别RSV融合蛋白(F),另两种单抗识别RSV核衣壳蛋白(N)。单抗中和效价最高达1∶64。相加指数证实5种单抗识别不相关的抗原表位。用硫氰酸铵洗脱法比较了五种单抗相对亲和力的大小,依次为:1#>2#>4#>3#>5#。所有杂交瘤细胞株,经连续3个月培养及冻存半年后复苏,细胞生长良好,检测上清,其分泌抗体效价稳定。结论:已获得抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体,为RSV感染的早期诊断及进一步研究奠定了基础。

单克隆抗体在呼吸道合胞病毒感染诊断和防治中的应用

呼吸道合胞病毒 (RSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的重要病原 ,目前尚无成熟疫苗应用于临床。展开对RSV被动免疫的研究显得尤为重要。单克隆抗体成为深入研究和防治RSV感染的有力武器。本文综述了单克隆抗体在RSV感染的诊断。

呼吸道合胞病毒单克隆抗体抵抗株的体内筛选

目的:Palivizum ab(PZ)是目前唯一用于防治感染性疾病的单克隆抗体药物,主要用于预防高危患儿RSV感染。体外筛选获得的PZ逃逸株F基因发生众多突变,且在棉鼠体内完全抵抗大剂量PZ预防效应。本研究评估RSV PZ逃逸株在动物体内是否出现。方法:用环磷酰胺(CY)腹腔注射法制备免疫抑制棉鼠模型,鼻腔接种病毒前24h或后6周肌注15m g/kg PZ。感染后12周收集棉鼠肺脏,用逆转录PCR法扩增RSV F基因片断并克隆入质粒载体,测定克隆cDNA序列筛查F基因突变。结果:在5只接受PZ预防或治疗的棉鼠中,3只棉鼠肺内病毒为含有逃逸株和原型株的混合群体;来自上述3只棉鼠的F基因cDNA克隆中,超过50%显示与体外PZ逃逸株相同的F基因突变。从其中1只棉鼠肺脏中分离的病毒抵抗PZ中和效应。结论:RSV在环磷酰胺处理的棉鼠模型肺内复制时间明显延长,在PZ筛选压力存在情况下,PZ逃逸株可在体内产生,并可能导致PZ预防或治疗失效,提示今后有必要在PZ使用人群中长期监控逃逸株是否出现。

老年呼吸系统疾病患者呼吸道合胞病毒感染状况

目的 了解广州地区部分老年呼吸系统疾病患者呼吸道合胞病毒 (RSV)感染状况。 方法 用间接酶联免疫吸附试验 (ELISA)、酶联免疫荧光试验 (ELFA)和逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)对老年呼吸疾病患者进行RSVIgG、RSV抗原、特异性核酸检测。 结果 164例呼吸疾病患者血清标本 ,RSVIgG阳性率为 39 63% ,其中老年组为 45 63% ,中青年对照组 2 7 87% (P <0 0 5 )。ELFA与RT PCR法检测支气管肺泡冲洗液标本中RSV抗原和RSVRNA阳性率分别为 10 98% ( 18/164)和 13 42 % ( 2 2 /164) ,2组比较无显著性差异。 结论 在有呼吸系统疾病的老年人中 ,RSV感染较为普遍 。

炭凝集试验快速检测呼吸道合胞病毒的研究

用炭凝集试验（ＣＡＴ）检测呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ），结果表明该法是一种简便、快速、特异的诊断方法。用ＣＡＴ对１６株ＲＳＶ和８株其它病毒做试验，结果仅ＲＳＶ凝集，而其它病毒均阴性。用该法与细胞培养法检测８３份临床呼吸道感染幼儿鼻咽吸出物，结果ＣＡＴ法阳性率为６９．８８％（５３／８３），细胞培养法为３９．７５％（３３／８３），两者阳性检出率相差极显著。阻断试验证明ＣＡＴ是高度特异的。结果证明ＣＡＴ具有较高的敏感性与特异性，可用于临床ＲＳＶ标本的快速检测。

呼吸道合胞病毒性婴幼儿肺炎快速诊断的研究

我们应用抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体(RSV McAb)免疫荧光法,检查了144例临床诊断为婴幼儿病毒性肺炎患儿咽部脱落细胞中的RSV特异性抗原,同时对部分病例做了病毒分离和(或)双份血清抗体测定对照检查,结果McAb荧光抗体法阳性率为58.4%(84/144),明显高于后两种方法(P值分剐为<0.01和<0.05),而且达到了特异敏感的要求。

呼吸道合胞病毒融合抑制活性单克隆抗体的鉴定及应用

用杂交瘤技术制备了抗呼吸道合胞病毒 (RSV Long株 )的单克隆抗体F3细胞株。经IFA及ELISA证明 ,F3株McAb对RSV抗原特异 ,具中和活性及融合抑制活性 ,其腹水中和效价和融合抑制效价分别为 1∶12 8和 1∶6 4。将F3株McAb与商售混合单抗试剂盒进行临床诊断比较 ,二者阳性符合率 96 .9% ,阴性符合率 10 0 %。

用标记分析法检测我国海南省登革2型病毒抗原性变化

我们试用标记分析法,用3种单克隆抗体(黄病毒科特异性、登革病毒属特异性和登革病毒2型型特异性单克隆抗体)研究了我国海南省1985～1987年3年内流行的登革2型病毒8个流行株的抗原性变化,并与标准株新几内亚B株进行了比较。发现6株与标准株类似,2株显示出明显的差异。标记分析法为病毒抗原分析提供了一个简便、快速的方法,可用来监测一个地区病毒株群的变化及新株的传入。

新疆部分地区集约化牛场牛呼吸道合胞体病毒的流行病学调查

为了解新疆部分地区集约化牛场牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的流行及分型情况,本研究从新疆7个地区14个集约化牛场采集了407头犊牛的血液及其对应的鼻拭子,分离血清,利用ELISA检测犊牛血清中的BRSV抗体,结果显示,犊牛血清中的BRSV抗体阳性率为82.1%(334/407),各地区BRSV抗体阳性率在70%~100%,其中克拉玛依和伊犁两地BRSV抗体阳性率高达100%。9周龄以内犊牛BRSV抗体阳性率较高,为86.1%~100%,但9周龄以后BRSV抗体阳性率呈下降趋势,且12周龄以上犊牛BRSV的抗体阳性率下降至31.8%。利用套式RT-PCR(F基因引物)对鼻拭子检测结果显示,仅伊犁、石河子两地共17份样品检测结果为BRSV阳性,阳性率分别为7.4%(2/27)和7.5%(15/200)。5周龄犊牛BRSV的阳性率最高为21.7%(5/23),且BRSV阳性的犊牛均在12周龄以内。上述结果表明,新疆部分地区牛场犊牛存在BRSV的感染,且BRSV抗体阳性率也较高,在不同地区犊牛BRSV及其抗体的阳性率均存在差异。采用套式RT-PCR扩增17份BRSV阳性样品的G基因并测序,利用MegAlign软件中的clustal W算法分析G基因的同源性,利用MEGA 7.0软件中的NJ法构建G基因的进化树,分析其遗传进化关系。结果显示,17份阳性样品均扩增到371 bp的G基因片段。同源性及遗传进化分析结果显示,17条G基因序列均与美国Ⅲ亚群BRSV参考株USII/S1 G基因的同源性最高,为91.6%~94.4%。且它们均与美国Ⅲ亚群BRSV参考株USII/S1位于同一大分支。上述结果表明,17条G基因序列可能均来自美国的BRSV USII/S1参考株,且均为Ⅲ亚群BRSV。本研究为新疆部分地区BRSV感染的防控提供了数据支持。

呼吸道合胞病毒L蛋白单克隆抗体的制备

目的:制备人呼吸道合胞病毒L蛋白单克隆抗体,并对其进行性质鉴定。方法:选取RSV-A2 L蛋白上具有亲水性可能的loop区段,将这些目的片段展示在HBc149上进行原核表达并纯化。重组蛋白免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,根据免疫后血清的ELISA和WB分析结果选择L3935和L4099组小鼠进行脾脏免疫。融合后,用间接ELISA法筛选和多次克隆化,获得稳定分泌抗L蛋白单克隆抗体细胞株,并结合ELISA、免疫荧光和免疫印迹对所获得的单抗进行鉴定。结果:获得11株L蛋白特异性单克隆抗体,亚类鉴定结果 IgG1、IgG2a和IgG3单抗各3株,IgG2b单抗2株。结论:成功制备了L蛋白特异性单克隆抗体,也为RSV感染的免疫和发病机制研究奠定基础。