CCN1siRNA对视网膜血管内皮细胞活性的抑制及其机制

背景富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）/CCN1在早产儿视网膜病变（ROP）的视网膜新生血管（RNV）形成中发挥重要作用，但目前国内外关于CCN1小干扰RNA（CCN1 siRNA）对ROP有无延缓和治疗作用的研究较少。 目的探讨特异性抑制CCN1的表达对视网膜血管内皮细胞的调控作用。 方法恒河猴脉络膜－视网膜内皮细胞株（RF/6A）分别于常氧（正常对照组）和低氧环境（体积分数1%O2、5%CO2和94%N2的混合气体）中培养，低氧环境培养的细胞分别采用脂质体Lipofectamine？2000介导转染空载体质粒（低氧对照组）和CCN1 siRNA表达质粒（CCN1 siRNA转染组），于细胞转染后24 h采用逆转录PCR法检测细胞中CCN1 siRNA重组质粒的表达情况；分别于培养后0、24、48、72和96 h采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法测定各组细胞活性并绘制细胞生长曲线；于培养后24 h采用流式细胞术检测各组培养细胞的增生和凋亡情况；于培养后24 h采用免疫荧光技术和Western blot法检测各组RF/6A细胞中CCN1和血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。 结果细胞转染后24 h用逆转录法检测到细胞中CCN1 siRNA的表达条带。CCK-8检测显示随着培养时间的延长，RF/6A细胞增生值（吸光度，A值）均明显增加，但CCN1 siRNA转染组各时间点细胞增生值均明显低于正常对照组和低氧对照组，总体比较差异均有统计学意义（F组别＝198.45，P〈0.05；F时间＝39.26，P〈0.05）；CCN1 siRNA转染组、正常对照组和低氧对照组细胞的凋亡率分别为（68.9±1.1）%、（18.9±1.3）%和（39.6±1.8）%，其中CCN1 siRNA转染组细胞的凋亡率明显高于正常对照组和低氧对照组，差异均有统计学意义（t＝2.93、2.56，均P〈0.05）；CCN1和VEGF蛋白在正常对照组细胞中呈弱表达，在低氧对照组细胞中表达均明显增强，CCN1 siRNA转染组细胞中CCN1和VEGF的相对表达量较低氧对照组均明显下降（均P〈0.05）。 结论CCN1 siRNA转染后能抑制RF/6A细胞的增生并促进其凋亡，CCN1 siRNA可下调缺氧环境下RF/6A细胞中CCN1和VEGF蛋白的表达水平，可能是抑制RNV形成的主要机制。

加强视网膜新生血管发生发展机制研究,为预防和治疗视网膜新生血管性疾病奠定基础

视网膜新生血管（RNV）形成是促血管生成因子和血管生成抑制因子之间平衡失调的一个复杂病理生理过程.正确理解RNV发生的相关信号通路及调控机制,深入探索启动RNV发生发展的关键因素,从重塑新生血管发生的角度出发,寻求改善RNV性疾病的新靶点均有助于深入了解RNV的发生发展机制,为临床预防和治疗RNV性疾病带来新的希望.

重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用

目的 观察重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子（rAAV2-PEDF）对氧诱导小鼠视网膜新生血管（RNV）的作用.方法 选择3日龄C57/BL6小鼠22只,左眼为实验服,右眼为对照眼,微量注射器玻璃体腔分别注射rAAV2-PEDF和rAAV2-绿色荧光蛋白1μl.注射后立即将小鼠放入氧箱,建立氧诱导血管增生性视网膜病变模型.取13日龄小鼠4只提取视网膜总蛋白,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表达.17日龄小鼠12只,荧光素心脏灌注视网膜铺片观察血管形态和分布.17日龄小鼠6只,视网膜冰冻切片外源凝集素标记后染色观察血管形态和分布.Image-Pro Plus5.1软件测量分析无荧光素灌注区和RNV的绝对面积和相对面积.结果 实验眼PEDF蛋白表达显著高于对照眼.视网膜铺片定量结果显示,实验眼和对照跟绝对无灌注区面积分别为（0.96±0.22）、（1.96±0.34）mm^2,差异有统计学意义（t=-8.554,P〈0.01）;相对无灌注区面积分别为（8.64±1.52）%、（17.27±2.98）%,差异有统计学意义（t=-8.97,P〈0.01）.实验眼和对照眼绝对新生血管面积分别为（0.37±0.11）、（1.26±0.38）mm^2,差异有统计学意义（t=-7.8,P〈0.01）;相对新生血管面积分别为（3.96±0.66）%、（11.45±2.06）%,差异有统计学意义（t=-8.51,P〈0.01）.外源凝集素标记定量结果显示,实验眼和对照眼RNV面积分别为（0.11±0.003）、（0.41 4-0.02）mm^2,差异有统计学意义（t=-5.14,P〈0.01）.结论 rAAV2-PEDF可成功转染小鼠视网膜组织并稳定表达PEDF蛋白,不仅可以减少氧诱导血管增生性视网膜病变小鼠视网膜无灌注面积,而且可显著抑制RNV生成.

血管能抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的 观察血管能抑素真核表达质粒（pCMV-HA）对小鼠视网膜新生血管RNV形成的抑制作用.方法 将鼠龄为7 d的56只C57BL/6J新生小鼠随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、治疗组和空载体组,每组14只.后3组小鼠置于（75±2）%浓度的氧环境中饲养5 d后,回到正常空气环境中建立氧诱导的RNV动物模型.治疗组小鼠在出生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射血管能抑素pCMV-HA,空载体组注射等量空质粒.出生后第17天行伊凡思蓝（Evans blue）灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化.石蜡切片行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数.结果 视网膜铺片结果显示,治疗组较OIR模型组和空载体组视网膜血管分布均匀,新生血管和无灌注区显著减少.治疗组突破内界膜的内皮细胞核数与OIR模型组及空载体组比较,差异有统计学意义（F=39.006,P〈0.001）.结论 血管能抑素pCMV-HA对氧诱导的RNV有显著的抑制作用.

重组腺病毒-p21抑制猴视网膜微血管内皮细胞增生的作用研究

目的观察重组腺病毒-p21（rAd-p21）对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞（RF／6A）增生的作用。方法体外培养RF／6A细胞系，分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、rAd-p21转染组及阴性对照组，并转入相应的质粒表达载体。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法及蛋白免疫印迹（Western blot）检测p21tuRNA及蛋自在RF／6A细胞中的表达；应用流式细胞仪检测p21基因对RF／6A细胞周期的影响；行内皮细胞体外成管实验观察p21基因对RF／6A细胞成管的抑制作用。结果rAd—p21转染组p21mRNA及蛋白表达显著增高。细胞周期检测结果显示，PBS组、rAd-p21转染组、阴性对照组G0／G1期细胞百分比分别为（40．76±6．66）%、（67．45±11．61）％、（41．55±8．99）％；tAdp21转染组RF／6A细胞出现GO／G1期阻滞，G0／G1期细胞比例增多。rAd—p21转染组与PBS组和阴性对照组比较，差异有统计学意义（F=21．284，P=0．000）。体外成管实验显示，PBS组、rAd—p21转染组、阴性对照组每一视野下内皮细胞成管数分别为（8．25±3．19）、（3．86±1．21）、（7．62±2．69）个；rAd—p21转染组与PBS组和阴性对照组比较，差异有统计学意义（F=7．138，P=0．004）。结论rAd—p21可成功转染RF／6A细胞并稳定表达p21mRNA及蛋白，并可显著抑制其增生。

重组腺病毒介导p21对小鼠视网膜新生血管生成的抑制作用

目的观察重组腺病毒-p21（rAd—p21）对氧诱导小鼠视网膜新生血管（RNV）的抑制作用。方法将56只健康7日龄C57BL／6J小鼠随机分为对照组、磷酸盐缓冲液（PBS）组、rAd-p21组及rAd-无目的基因对照（rAd—NC）组，每组14只。PBS组、rAd—p21组及rAd～NC组建立氧诱导RNV模型，并于小鼠11日龄时玻璃体腔分别注入1p1PBS、rAd—p21及rAd—NC。对照组不做任何处理。小鼠17日龄时，每组处死4只小鼠，摘取眼球分别作荧光视网膜铺片和切片，观察小鼠RNV发生情况；Image-Proplus6．0软件测量分析无灌注区面积；同时提取视网膜总RNA和总蛋白，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测p21、细胞周期素依赖蛋白激酶2（CDK2）mRNA及蛋白在视网膜组织中的表达。结果荧光及光学显微镜观察发现，rAd—p21组小鼠视网膜无灌注区、新生血管及突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核较PBS组和rAd—NC组减少；tAd—p21组无灌注区面积较PBS组和rAd—NC组明显减少，组间差异有统计学意义（F=101．634，P〈O．05）。RT—PCR及Westernblot检测结果显示，rAd—p21组p21mRNA和蛋白表达明显高于对照组、PBS组及rAd—NC组，组间差异有统计学意义（F=839．664、509．817，P〈0．05）；rAd—p21组CDK2mRNA和蛋白表达明显低于对照组、PBS组及rAd—NC组，组间差异也有统计学意义（F=301．858、592．882，P〈0．05）。结论rAd-p21可通过上调p21表达、降低CDK2表达，抑制RNV生成。

15-脂氧合酶-1基因转移抑制小鼠视网膜新生血管的实验研究

目的观察15-脂氧合酶-1（15-LOX-1）基因转移对氧诱导小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法7日龄C57BL／6J小鼠96只，随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、基因治疗组和空白载体组。将小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为（75±2）％的氧箱内饲养5d后转移至正常环境中饲养5d，建立OIR模型。小鼠出生后第12天基因治疗组玻璃体腔注射携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和小鼠15-LOX-1基因的重组腺病毒（Ad-15-LOX-1—EGFP）载体1p1；空白载体组注射等量携带EGFP的重组腺病毒（Ad—EGFP）载体。注射后第2天行视网膜铺片荧光显微镜观察EGFP的表达。注射后第5天行免疫荧光染色法、实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测15-LOX-1基因转染视网膜的表达；视网膜铺片观察视网膜血管变化，测量视网膜无灌注区和新生血管的相对面积；石蜡切片苏木精-伊红染色并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。结果Ad-15-LOX-1-EGFP注射第2天，视网膜铺片上观察到EGFP的表达。免疫荧光染色结果显示，15-LOX-1基因转染视网膜主要表达在外丛状层、内核层和神经节细胞层。基因治疗组15-LOX-1蛋白和mRNA表达水平明显高于OIR模型组和空白载体组，差异有统计学意义（t蛋白表达水平-22．74、24．13，tmRNA表达水平-12．51、13．40；P〈0．01）；基因治疗组视网膜无灌注区和新生血管面积较OIR模型组和空白载体组显著减小，差异有统计学意义（t无血管区面积=16．22、14．31，t新生血管面积=9．97、9．07；P（0．01）；基因治疗组中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核与0IR模型组和空白载体组比较明显减少，差异有统计学意义（f-14．25、11．62，P（0．01）。结论15-LOX-1基因转移不仅可以减少氧诱导小鼠视网膜无灌注区面积，并且对视网膜新生血管有显著的抑制作用。

Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA干扰活性氧-核因子κB通路抑制小鼠视网膜新生血管生成

目的 观察Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA（Racl-shRNA）在小鼠氧致视网膜病变中对视网膜新生血管（RNV）生成的抑制作用及对活性氧（ROS）-核因子κB（NF-κB）通路的影响.方法 将108只7日龄C57BL/6J小鼠随机平均分为3组.其中2组Smith法建立氧致视网膜病变模型;11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒或无意义质粒,分别作为基因干预组和空白对照组.第3组于正常氧环境中饲养,11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒作为空白干预组.15、17日龄时行荧光视网膜铺片,观察视网膜血管发育及新生血管情况.17日龄时计数眼球切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数.17日龄时进行原位杂交法和荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应法检测小鼠视网膜Racl和NF-κB p65亚单位的mRNA含量;免疫组织化学和蛋白质免疫印记检测Racl和NF-κB p65的蛋白表达.结果 基因干预组视网膜Racl的mRNA水平较空白对照组明显下调（t=4.500,P=0.001）.与空白对照组比较,基因干预组视网膜铺片中无灌注区、荧光渗漏和新生血管丛明显减轻,突破内界膜的血管内皮细胞核显著减少（t=6.521,P〈0.001）;视网膜NF-κB p65的核易位水平明显下降（t=16.008,P〈0.001）,同时mRNA表达亦明显下调（t=3.354,P=0.006）,与Racl mRNA表达呈正相关（r=0.580,P=0.012）.结论 小鼠玻璃体腔注射脂质体包裹的Racl-shRNA表达质粒可有效沉默视网膜Racl基因表达,阻断ROSNF-κB通路而参与抑制相对缺氧状态下RNV生成.

可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1不同基因片段对视网膜新生血管的抑制作用

目的 观察可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1（sFlt-1）不同基因片段对小鼠视网膜新生血管（RNV）的抑制作用.方法 构建携带sFlt-1（2～3）、（2～4）免疫球蛋白样区域编码基因的重组慢病毒sFlt-1（2～3）和sFlt-1（2～4）.鼠龄7 d的C57/6J小鼠96只,数字表法随机分为4组,每组24只.1组为正常对照组;2组为模型对照组;3组为sFlt-1（2～3）组;4组为sFlt-1（2～4）组.2、3、4组置于（75±2）%氧浓度环境,出生后12 d再置于正常空气下饲养,并分别玻璃体腔注射空病毒、慢病毒sFlt-1（2～3）和sFlt-1（2～4）各1μl.出生后17 d,荧光素灌注造影行视网膜铺片,观察视网膜血管改变;视网膜切片行苏木精-伊红染色,计数小鼠RNV细胞核数;蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测视网膜血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体-2含激酶插入区受体/胎肝激酶-1（KDR/Flk-1）的蛋白表达.结果 出生后17 d,与2组比较,3、4组视网膜荧光渗漏面积、RNV、突破内界膜（ILM）的血管内皮细胞核数均明显减少（P〈0.01）;VEGF蛋白表达无明显变化（P〉0.05）,KDR/F1k-1蛋白表达明显下降（P〈0.01）.结论 sFlt-1（2～3）和sFlt-1（2～4）基因片段能明显抑制氧诱导小鼠RNV的形成,sFlt-1（2～3）效果更为显著.

Twist基因干扰抑制猴视网膜微血管内皮细胞的迁移

目的 观察Twist基因干扰对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞（RF/6A）迁移及磷酸化Akt（pAkt）蛋白表达的影响.方法 体外培养的RF/6A细胞系,并构建Twist干扰质粒和对照质粒.分为Twist干扰质粒组、阴性对照组、磷酸盐缓冲液（PBS）组,各组应用脂质体基因转染方法,转入相应的质粒表达载体,采用Transwell小室法检测发生迁移的内皮细胞并计数;铺Matrigel胶,行内皮细胞体外成管实验,观察Twist基因干扰对内皮细胞成管的抑制作用;蛋白质免疫印迹检测Twist基因干扰对RF/6A细胞pAkt蛋白表达的影响.结果 Transwell小室计数结果表明,转染Twist干扰质粒后,迁移的细胞数显著低于阴性对照组和PBS组（F=23.786,P=0.000）.体外成管实验结果表明,Twist干扰质粒组内皮细胞成管数显著低于阴性对照组和PBS组（F=7.159,P=0.014）.Ttwist干扰质粒组的pAkt蛋白表达明显减少.结论 Twist基因干扰可显著抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,可能机制是通过抑制pAkt蛋白的表达发挥作用.

慢病毒介导环腺苷酸反应成分结合蛋白1特异性小干扰RNA对小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的 观察玻璃体腔注射慢病毒介导环腺苷酸反应成分结合蛋白1（CREB1）特异性小干扰RNA（siRNA）对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 构建针对小鼠靶基因CREB1 siRNA载体,筛选并进行慢病毒包装.将140只C57BL/6J小鼠均分为正常对照组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、空载体组和CREB1干扰组.正常对照组小鼠在正常空气中饲养.OIR模型组、空载体组和CREB1干扰组小鼠均于出生后7d建立OIR模型.空载体组及CREB1干扰组小鼠于出生后5d分别行玻璃体腔注射慢病毒-绿色荧光蛋白（GFP）空载体和CREB1-RNA干扰慢病毒载体1.0μl.利用突破内界膜的新生血管内皮细胞核数和荧光血管造影视网膜铺片评价视网膜新生血管情况;计算小鼠视网膜新生血管和无灌注区面积;逆转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测小鼠视网膜CREB1 mRNA和磷酸化CREB1 （P-REB1）蛋白表达,以及血管内皮生长因子（VEGF）-A、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的mRNA和蛋白表达情况.结果 OIR模型组、空载体组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较正常对照组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;CREB1干扰组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较OIR模型组、空载体组明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）.OIR模型组、空载体组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较正常对照组明显增大,CREB1干扰组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较OIR模型组和空载体组明显缩小.4组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积比较,差异均有统计学意义（F=67.220、110.090,P＜0.05）.OIR模型组、空载体组小鼠视网膜CREB1 mRNA和P-CREB蛋白表达以及VEGF-A、Akt、PI3K mRNA和蛋白表达均较正常对照组明显增加;CREB1干扰组小鼠视网膜CREB1 mRNA和P-CREB蛋白表达以及VEGF-A、Akt、PI3K mRNA和蛋白表达较OIR模型组、空载体组明显下降.4组小鼠视网膜CREB1、VEGF-A、Akt、PI3K mRNA表达比较,差异均有统计学意义（F-6.087、5.464、6.191、8.627,P＜0.05）.4组小鼠视网膜P-CREB1、VEGF-A、Akt、PI3K蛋白表达比较,差异也有统计学意义（F=162.944、13.861、19.710、22.827,P＜0.05）.结论 玻璃体腔注射慢病毒介导的CREB1 siRNA转染视网膜可有效抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的形成.

半乳糖凝集素-1抑制剂OTX008对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的 观察半乳糖凝集素-1（Galectin-1）特异性抑制剂OTX008对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管（RNV）的抑制作用,并探讨其作用机制.方法 7日龄C57BL/6J小鼠128只采用随机数字表法随机分为正常组、单纯模型组、OTX008干预组和磷酸盐缓冲液（PBS）空白对照组,每组32只.正常组小鼠在正常氧环境下饲养;其余3组小鼠建立氧诱导视网膜病变模型.小鼠12日龄时,OTX008干预组小鼠双眼按0.25μg/μl的剂量玻璃体腔注射OTX008 1 μl,PBS空白对照组注射等体积PBS.正常组及单纯模型组小鼠不做其他任何干预和处理.小鼠17日龄时,各组作视网膜冰冻切片并行免疫荧光染色,定性观察Galectin-1蛋白的分布情况;作视网膜组织石蜡切片并行苏木精-伊红染色,计数突破内界膜的血管内皮细胞核;作全视网膜铺片并行免疫荧光染色,观察视网膜血管变化并统计RNV区、无灌注区、缺氧区面积;采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测Galectin-1、神经纤毛蛋白质-1（Neuropilin-1）、磷酸化血管内皮生长因子受体2（pVEGFR2）的蛋白相对表达量.结果 与正常组比较,单纯模型组、PBS空白对照组小鼠视网膜Galectin-1蛋白荧光在视网膜神经节细胞层、内丛状层及内核层明显增强;OTX008干预组小鼠视网膜Galectin-1蛋白荧光较单纯模型组、PBS空白对照组明显减弱.单纯模型组、PBS空白对照组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核计数较正常组明显增加,差异有统计学意义（t=9.314,P＜0.05）;OTX008干预组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核计数较单纯模型组、PBS空白对照组明显下降,差异有统计学意义（t=8.038、7.774,P＜0.05）.与单纯模型组、PBS空白对照组比较,OTX008干预组小鼠RNV区（t=13.250、12.570）、无灌注区（t=15.590、12.430）和缺氧区（t=9.542、9.928）面积明显减小,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western blot检测结果显示,与单纯模型组及PBS空白对照组相比,OTX008干预组小鼠视网膜Galectin-1（t=24.800、23.060）、Neuropilin-1（t=4.120、3.530）、pVEGFR2（t=25.880、15.480）蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 Galectin-1特异性抑制剂OTX008可抑制氧诱导RNV形成,降低视网膜组织缺氧.其机制可能与抑制Galectin-1表达,减少Galectin-1与Neuropilin-1结合,降低pVEGFR2表达有关.

5-脂氧合酶对缺氧诱导的视网膜新生血管形成的抑制作用

目的 观察5-脂氧合酶（5-LOX）对缺氧诱导的视网膜新生血管形成的抑制作用,探讨视网膜新生血管形成的可能机制.方法 鼠龄为7d的C57BL/6J幼鼠随机分为正常组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、大剂量干预组、小剂量干预组、干预对照组.各组分别为12只.除正常组外,其余各组小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为（75±2）％的氧箱内饲养5d后转移至正常环境中饲养5d,建立OIR模型.12～17日龄时,大剂量干预组、小剂量干预组小鼠腹腔每天分别注射100、50 mg/kg 5-LOX抑制剂去甲二氢愈创木酸;干预对照组小鼠腹腔每天注射等体积1％二甲基亚砜;OIR模型组小鼠出氧箱后不作任何处理.石蜡切片苏木精-伊红染色并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核,CD34标记鼠新生血管内皮细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT PCR）检测视网膜中5-LOX、血管内皮生长因子（VEGF）-a、VEGF受体-2（VEGFR-2）的mRNA含量.蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测视网膜中5-LOX、VEGF-a、VEGFR-2、细胞外磷酸化信号调节蛋白激酶（P-ERK） 1/2的蛋白表达含量.结果 不同剂量干预组突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数较OIR模型组、干预对照组明显减少,差异有统计学意义（F=73.390,P＜0.05）.RT-PCR、Western blot检测结果显示,不同剂量干预组小鼠视网膜5-LOX、VEGF-a、VEGFR-2的mRNA和蛋白表达均较OIR模型组、干预对照组减少,差异有统计学意义（F=92.668,P＜0.05）;大剂量干预、小剂量干预组之间VEGFR-2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（F=2.118,P＞0.05）;5-LOX、VEGF-a、P-ERK 1/2相对蛋白表达比较,差异均有统计学意义（F=86.490、165.128、139.424,P＜0.05）.结论 缺氧可以诱导视网膜中5-LOX的高表达;5 LOX选择性抑制可以降低其表达并减少缺氧诱导的新生血管形成.

钙结合蛋白S1O0A4基因静默对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用及其机制

目的观察探讨钙结合蛋白S100A4基因静默对氧诱导视网膜新生血管（RNV）的抑制作用及其机制。方法7日龄C57BL／6J小鼠150只随机分为正常组、正常-病毒对照组、单纯模型组、基因治疗组、空白载体组，每组30只。正常组、正常-病毒对照组小鼠在常氧环境下饲养；其余3组小鼠建立氧诱导视网膜病变模型。小鼠12日龄时，基因治疗组及空白载体组小鼠双眼玻璃体腔注射病毒滴度为1．0×10^9PFU／mI的携带针对S100A4小干扰RNA的重组腺病毒载体（Ad—S100A4-RNAi）和带绿色荧光蛋白的空白腺病毒载体各1．0μl；正常-病毒对照组小鼠玻璃体腔注射同样滴度的等量Ad～S100A4-RNAi。正常组及单纯模型组小鼠不做任何处理。小鼠15日龄时，基因治疗组和正常组作视网膜组织冰冻切片观察病毒转染情况。小鼠17日龄时，各组作视网膜组织切片，计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核；作全视网膜铺片免疫荧光染色，观察视网膜血管变化；蛋白免疫印迹法（Westernblot）及实时PCR检测小鼠视网膜S100A4、B细胞淋巴瘤／白血病-2基因（bcl-2）、半胱天冬酶（Caspase）-3及环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的蛋白和mRNA表达。结果荧光显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜未见病毒绿色荧光，仅可见少量自身荧光；基因治疗组小鼠视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层可见病毒绿色强荧光，外核层可见少量弱荧光。单纯模型组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较正常组明显增加，差异有统计学意义（t=15．68，P〈0．05）；基因治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较单纯模型组、空白载体组明显下降，差异均有统计学意义（t=13．61、14．64，P〈0．05）。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠RNV面积、无灌注区面积明显减少，差异均有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot及实时PCR检测结果显示，与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、CREB蛋白及mRNA表达明显下调，差异均有统计学意义（P〈0．05）；Caspase-3蛋白及mRNA表达明显上调，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论S100A4基因静默可抑制氧诱导RNV。其机制可能与S100A4基因静默下调bcl-2、CREB表达，上调Caspase-3表达作用有关。

重组腺相关病毒-多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜新生血管形成的抑制作用

目的 观察重组腺相关病毒（rAAV）-多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用.方法 7日龄C57BL/6J小鼠18只,随机分为正常组、rAAV-PSF注射组、rAAV注射组,各组均6只.蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组小鼠视网膜组织中PSF的表达.7日龄C57BL/6J小鼠48只随机分为正常组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、OIR rAAV-PSF治疗组、OIR rAAV治疗组,各组均为12只.除正常组外,其余各组小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为（75±2）％的氧箱内饲养5d后转移至正常环境中饲养5d,建立OIR模型.12日龄时,OIR rAAV-PSF治疗组小鼠玻璃体腔注射病毒滴度为5×10^13pfu/ml的rAAV-PSF重组载体2μI; OIR rAAV治疗组小鼠玻璃体腔注射相同病毒滴度的单纯rAAV载体2μl.OIR模型组小鼠出氧箱后不作任何处理.石蜡切片苏木精-伊红染色并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;Western blot检测视网膜中VEGF蛋白表达含量.结果 正常组小鼠视网膜PSF蛋白表达与rAAV-PSF注射组比较,差异有统计学意义（F=16.05,P=0.001）,与rAAV注射组比较,差异无统计学意义（F=16.05,P=0.890）.正常组、OIR模型组、OIR rAAV-PSF治疗组、OIR rAAV治疗组突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数比较,正常组与OIR模型组差异有统计学意义（F=101.00,P=0.007）;rAAV-PSF治疗组与OIR模型组差异有统计学意义（F=101.00,P=0.002）;OIR rAAV治疗组与OIR模型组差异无统计学意义（F=101.00,P=0.550）.各组视网膜VEGF蛋白表达比较,正常组与OIR模型组差异有统计学意义（F=13.20,P=0.005）,OIR模型组与OIR rAAV-PSF治疗组差异有统计学意义（F=13.20,P=0.001）;OIR模型组与OIR rAAV组差异无统计学意义（F=13.20,P=0.071）.结论 rAAV-PSF玻璃体腔注射可以抑制OIR小鼠视网膜VEGF表达,从而抑制其新生血管生成.

慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。

慢病毒介导的微小RNA-191对小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导(LV)的微小RNA (miR)-191对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用。方法7日龄C57BL/6J小鼠80只,随机分为正常组、非干预组、LV miR-191 (LV-191)组、生理盐水(NS)组、LV-绿色荧光蛋白(GFP)组,每组均为16只。参照文献方法建立OIR小鼠模型。12日龄时,LV-191组、NS组、LV-GFP组,小鼠右眼玻璃体腔分别注射1 μl LV-191、NS、LV-GFP;正常组、非干预组小鼠不做处理。视网膜铺片观察视网膜无灌注区相对面积,病理切片计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;实时定量PCR (RT-PCR)检测小鼠视网膜中LV-191、p21 mRNA相对表达量。结果正常组、非干预组、LV-191组、NS组、LV-GFP组小鼠视网膜无灌注区面积比较,差异有统计学意义(F=127.20,P<0.001);突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较,差异有统计学意义(F=31.71 ,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,正常组、非干预组、LV-191组、NS组、LV-GFP组小鼠视网膜中miR-191、p21 mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=10.95、15.60,P<0.05、<0.05)。与正常组、非干预组、NS组、LV-GFP组小鼠比较,LV-191组视网膜中miR-191、p21 mRNA相对表达量均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的miR-191可通过上调p21表达抑制RNV的生成。

腺病毒介导的重组 Tum5基因抑制视网膜新生血管的实验研究

目的：观察腺病毒介导的重组 Tum5基因（rAd-Tum5）对氧诱导视网膜病变（OIR）模型小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法7日龄 C57BL/6J 小鼠96只,随机分为正常组、OIR 组、rAd-绿色荧光蛋白（GFP）空载体组（OIR rAd-GFP 组）和重组 Tum5基因组（OIR rAd-Tum5组）,每组均为24只。参照文献方法建立 OIR 模型。12日龄时,OIR rAd-GFP 组、OIR rAd-Tum5组小鼠双眼玻璃体腔分别注射病毒滴度为1±1011 pfu/ml 的 rAd-GFP、rAd-Tum5病毒1μl。OIR 组、正常组小鼠双眼玻璃体腔分别注射等体积无菌生理盐水。视网膜铺片观察视网膜无灌注区相对面积,病理切片计数突破内界膜的视网膜前细胞核数,免疫荧光法及蛋白免疫印迹法检测小鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）表达情况。结果正常组、OIR 组、OIR rAd-GFP 组、OIR rAd-Tum5组小鼠视网膜无灌注区相对面积比较,差异有统计学意义（F =61.224,P 〈0.01）。组间视网膜无灌注区相对面积比较,OIR rAd-GFP组与 OIR 组差异无统计学意义（P =0.827）；OIR rAd-Tum5组与 OIR 组、OIR rAd-GFP 组差异均有统计学意义（P 〈0.01）。4组间突破内界膜的视网膜前细胞核数比较,差异有统计学意义（F =635.738,P 〈0.01）。组间突破内界膜的视网膜前细胞核数比较,OIR rAd-GFP 组与 OIR 组差异无统计学意义（P =0.261）；OIR rAd-Tum5组与 OIR 组、OIR rAd-GFP组差异有统计学意义（P〈0.01）。与正常组小鼠视网膜 VEGF 表达比较,OIR 组和OIR rAd-GFP组 VEGF 表达均上调,OIR rAd-Tum5组小鼠视网膜 VEGF 表达较 OIR 组和 OIR rAd-GFP 组呈下降趋势。结论重组 rAd-Tum5基因可以抑制视网膜新生血管生成,可能与下调 VEGF 表达有关。