视网膜色素上皮—脉络膜在近视发病中的作用

目的 :探讨人眼视网膜色素上皮细胞 (RPE)、黑素细胞、成纤维细胞与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、β转化生长因子 (TGF β)和肝细胞生长因子 (HGF)的关系。 方法 :①用不含血清的培养液培养三种细胞 48h ,收集培养液 ,用酶标免疫吸附法测量生长因子含量 ;②将各种生长因子加入含有三种不同细胞的培养液中 ,五天后行细胞计数。结果 :在RPE和成纤维细胞培养液中能测出HGF、bFGF和TGF ,而在黑素细胞培养液中则不能测出。bFGF能刺激上述三种细胞的生长 ,HGF能刺激RPE与黑素细胞的生长 ,而TGF β能抑制三种细胞的生长。结论 :RPE、成纤维细胞和黑素细胞具有上述生长因子受体 ,其中RPE和成纤维细胞还能产生上述生长因子。视网膜产生的各种与近视有关的信使不能透过RPE—脉络膜 ,所以不能直接作用于巩膜。RPE、成纤维细胞和黑素细胞通过产生、抑制和应答各种生长因子、神经递质及激素 。

急性后极部多灶性鳞状色素上皮病变的吲哚青绿血管造影

目的探讨急性后极部多灶性鳞状色素上皮病变（ａｃｕｔｅｐｏｓｔｅｒｉｏｒｍｕｌｔｉｆｏｃａｌｐｌａｃｏｉｄｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｏｐａｔｈｙ，ＡＰＭＰＰＥ）的发病机制及病变的变化规律。方法用眼底荧光血管造影（ｆｕｎｄｕｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ，ＦＦＡ）和吲哚青绿血管造影检查（ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅｇｒｅｅｎａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ，ＩＣＧＡ）观察本病的改变，共６例（８只眼），其中１例观察１６０天。结果①ＦＦＡ：３只眼急性病变病灶早期为弱荧光，以后着染荧光。５只眼陈旧病灶为色素上皮脱色素的窗样缺损及色素沉着的遮蔽荧光；②ＩＣＧＡ：３只眼急性期病变呈斑片状充盈缺损，４只眼陈旧病灶弱荧光斑未见恢复，１只眼无异常表现。结论本病变发病为脉络膜毛细血管阻塞。

热休克蛋白47在增生性玻璃体视网膜病变增生膜组织的表达以及转化生长子因2-β对视网膜色素上皮细胞中热休克蛋白47表达的影响

目的：观察热休克蛋白（HSP）47在增生性玻璃体视网膜病变（PVR）增生膜中的表达及转化生长因子（TGF）-β2对视网膜色素上皮（RPE）细胞 HSP47表达的影响。方法收集行玻璃体切割手术的PVR 患者增生膜病理标本,苏木精-伊红、Masson 及免疫组织化学染色,观察其组织病理特征及 HSP47的表达。加入浓度分别为0、1、5、10 ng/ml 的 TGF-β2刺激培养人 RPE（ARPE-19）细胞,并根据此浓度此分为4组；浓度为5 ng/ml TGF-β2刺激细胞0、12、24、48 h。荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞内 HSP47、Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）的 mRNA 和蛋白表达情况。结果光学显微镜观察发现,PVR 增生膜中可见类圆形上皮样细胞及色素颗粒,大量胶原蛋白成分；HSP47在多数上皮样细胞胞浆及间质内呈阳性表达。RT-PCR 检测结果显示,1、5、10 ng/ml 组细胞内 HSP47、Col-ⅠmRNA表达较0 ng/ml 组分别上调了1.32、2.35、1.85倍和1.29、1.52、2.11倍,差异均有统计学意义（HSP47：F =27.21,P 〈0.05；Col-Ⅰ：F =23.45,P 〈0.05）；TGF-β2作用0、12、24、48 h 后,细胞内 HSP47、Col-ⅠmRNA 表达较0 h 分别上调了1.56、1.84、2.86倍和1.57、1.86、2.78倍,差异均有统计学意义（HSP47：F =31.56,P 〈0.05；Col-Ⅰ：F =54.43,P 〈0.001）。Western blot 检测结果显示,1、5、10 ng/ml 组细胞内HSP47、Col-Ⅰ蛋白表达较0 ng/ml 组分别上调了2.33、2.89、2.60倍和1.18、1.49、2.11倍,差异均有统计学意义（HSP47：F =39.78,P 〈0.05；Col-Ⅰ：F =29.10,P 〈0.05）。TGF-β2作用12、24、48 h 后,细胞内HSP47、Col-Ⅰ蛋白表达量较0 h 分别上调了2.08、2.37、2.80倍和1.38、1.59、2.16倍,差异均有统计学意义（HSP47：F =49.18,P〈0.05；Col-Ⅰ：F =42.52,P〈0.05）。结论 HSP47在 PVR 增生膜中呈阳性表达,TGF-β2可能通过促进 ARPE-19细胞 HSP47的表达,增加 Col-Ⅰ的合成与沉积。

维甲酸诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的研究维甲酸（ｒｅｎｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ，ＲＡ）诱导的视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｌｉｕｍ，ＲＰＥ）细胞凋亡特征。方法体外培养的ＲＰＥ细胞中加入１０－５、１０－６、１０－７ｍｏｌ／ＬＲＡ，应用吖啶橙荧光染色和核苷酸末端转移酶介导的ｄＵＩＰ末端标记法（ＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ＴＵＮＥＬ法）观察凋亡细胞。结果１０－５、１０－６、１０－７ｍｏｌ／ＬＲＡ诱导ＲＰＥ细胞凋亡，凋亡细胞表现为细胞固缩，染色质凝聚。ＴＵＮＥＬ法显示凋亡细胞ＤＮＡ片断化。１０－７、１０－６、１０－５ｍｏｌ／ＬＲＡ作用５天时，凋亡指数分别为３６．９％、４４．９％、６１．４％。作用６天时，凋亡指数分别为４８．０％、５９．９％、７４．２％。经统计学处理，同一ＲＡ浓度时，随作用时间延长凋亡指数增加；同一作用时间时，随ＲＡ浓度增大凋亡指数增加，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结论ＲＡ能诱导ＲＰＥ细胞凋亡。

基质金属蛋白-9抑制剂阻断视网膜色素上皮细胞表面CD73脱落防治实验性自身免疫性葡萄膜炎的初步研究

目的:初步探讨MMP-9抑制剂阻断RPE细胞表面CD73脱落,防治实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)的机制。方法:体外培养分离自野生型C57BL/6小鼠及CD73基因敲除(CD73-/-)小鼠的RPE细胞,以脂多糖及TNF-α共同干预,诱导RPE表面CD73脱落。依据是否同时加入MMP-9抑制剂CTK8G1150(终浓度5.0μmol/L),将两种小鼠培养的RPE细胞分别设为MMP-9抑制剂干预组及无干预对照组。每组细胞给予溶媒、1μmol/L单磷酸腺苷(AMP)、1μmol/L AMP及3μmol/L 5'-α,β-亚甲基-二磷酸腺苷(APCP)(AMP+APCP)进行干预。氚化胸苷掺入法检测不同组别RPE细胞对CD4+T细胞增生的刺激作用。分别以野生型B6小鼠及CD73-/-小鼠为受体,过继免疫诱发EAU。受体小鼠分别随机分为MMP-9抑制剂干预组及未干预对照组,于过继免疫后4、7、10 d视网膜下腔分别注射CTK8G1150或溶媒。实时定量PCR(RT-PCR)、Western blot法检测受体小鼠RPE细胞中CD73 mRNA及蛋白表达。组间比较采用单因素方差分析。结果:刺激方式为AMP时,C57BL/6 MMP-9抑制剂干预组CD4+T细胞的增生能力较无干预组显著下降,差异有统计学意义(F=13.28,P<0.01);溶媒、AMP+APCP时,两组CD4+T细胞增生能力比较,差异无统计学意义(F=7.78、6.58,P>0.05)。CD73-/-MMP-9抑制剂干预组、无干预组不同刺激方式CD4+T细胞增生能力比较,差异均无统计学意义(F=5.24、6.12、7.04,P>0.05)。RT-PCR检测结果显示,B6受体小鼠MMP-9抑制剂组、无干预对照组RPE细胞中CD73 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(F=6.54,P>0.05)。Western blot检测结果显示,B6受体小鼠MMP-9抑制剂组RPE细胞中CD73蛋白表达较未干预对照组显著增加,差异有统计学意义(F=15.24,P<0.01)。结论:MMP-9抑制剂阻断RPE细胞表面CD73的脱落对EAU具有保护作用。

黄斑色素与黄斑区视锥细胞功能相互关系的临床观察

目的 探讨黄斑色素 (macular pigment,MP)与黄斑区视锥细胞功能的相互关系。 方法 对临床确诊的 16例 Stargardt患者的 32只眼 ,3例黄斑裂孔患者的 3只眼用激光扫描检眼镜 (scanninglaserophthalmoscope,SL O)进行黄斑区 MP密度的检测。通过 SL O的氩激光蓝色及红外波段进行 MP的诊断与密度分级。用自编的计算机 C+ + 程序进行 MP密度评估 ,并将 MP分为完整 MP、部分 MP及 MP缺失 3级。对比分析 MP分级与 Snellen视力检查结果的相互关系。 结果 视力低于 2 0 / 2 0 0的 13只眼全部表现为 MP缺失 ;视力等于或高于 2 0 / 4 0的 11只中 10只眼表现为完整 MP,1只眼表现为部分 MP;视力介于两者之间的 11只眼表现为部分 MP。检测结果无病种间的差别。 结论 MP与患者的视力密切相关 ,是黄斑区视锥细胞功能完整的标志。

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子-蛋白激酶C信号通路的影响

目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2-）-蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响.方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验.采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度.采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响.采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤.将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组.其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA.用乙酰氧基甲基酯Ca2＋荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2＋浓度.比较各组细胞内Ca2＋浓度差异.结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功.100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）.100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）.蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）.单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca2＋浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca2＋浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）.结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca2＋浓度增高.硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca2＋浓度,PMA增加细胞内Ca2＋浓度.

蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞分泌外泌体与核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白炎性体的相关性研究

目的观察蓝光诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞外泌体对核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白（NLRP3）炎性体相关因子表达的影响。方法人RPE细胞株贴壁细胞分为实验组和对照组。实验组细胞以蓝光照射6h建立光损伤模型；对照组细胞常规培养。分级低温超速离心法获得两组细胞外泌体，透射电子显微镜观察其形态；蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测两组细胞外泌体表面CD63及白细胞介素（IL）-113、IL-18、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1）蛋白相对表达水平。将两组细胞外泌体作用于正常RPE细胞，据此分为蓝光诱导细胞外泌体＋实验组、正常细胞外泌体＋对照组。培养24h后，Westernblot检测两组细胞外泌体中IL-113、IL．18、caspase．1蛋白表达；荧光实时定量聚合酶链反应检测两组细胞中NLRP3mRNA表达。结果实验组细胞发生损伤失去原有形态；外泌体均呈双凹托盘状，直径50~200nm；实验组细胞外泌体中IL-113（t=18．04）、IL-18（t=-12．55）、caspase-1（t=14．70）蛋白表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．001）。蓝光诱导细胞外泌体＋实验组细胞外泌体中IL．1B（t=-i8．59）、IL．18（t=23．95）、caspase．1（t-=35．27）蛋白表达量明显高于正常细胞外泌体＋对照组，差异均有统计学意义（P〈0．001）；蓝光诱导细胞外泌体＋实验组、正常细胞外泌体＋对照组细胞内NLRP3mRNA相对表达量分别为1．000±0．069、0．200±0．010，两者比较，差异有统计学意义（t=-12．20，P〈0．001）。结论蓝光诱导RPE细胞外泌体可使RPE细胞内NLRP3炎性体相关细胞因子IL．1B、IL．18、caspase-1蛋白和NLRP3mRNA表达上调。

小干扰RNA介导丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响

目的 观察丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮（RPE）细胞的影响。方法 体外培养人RPE细胞，取第8～12代生长良好的传代细胞用于实验。将细胞分为正常对照组、光损伤模型组。采用波长400 nm的蓝色节能灯以（2000±500） Lux持续光照RPE细胞6 h建立光损伤模型。建模后光损伤模型组再分为针对HtrA1的小干扰RNA（HtrA1 siRNA）组、阴性对照组、空白对照组。应用脂质体RNAimax将HtrA1 siRNA转染至HtrA1 siRNA组细胞；阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA；空白对照组为单纯光损伤细胞。采用细胞计数试剂盒、transwell小室法及流式细胞仪检测各组细胞增生、迁徙、凋亡以及细胞周期情况；实时聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测细胞中HtrA1和血管内皮生长因子A（VEGF-A）mRNA、蛋白质表达。结果 光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组细胞明显升高，差异有统计学意义（t=17.62、15.09，P＜0.05）。与阴性对照组、空白对照组比较，HtrA1 siRNA组细胞增生（t=6.37、4.52）、迁徙能力（t=9.56、12.13）、凋亡率（t=23.37、29.08）明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞停留在G0/G1期数目增多（t=6.24、4.93），差异有统计学意义（P＜0.05）；HtrA1、VEGF-A mRNA（t=17.36、11.32、7.29、4.05）和蛋白（t=12.02、15.28、4.98、6.24）表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 特异性沉默HtrA1基因表达可降低蓝光对人RPE细胞增生、迁徙能力的损伤和细胞凋亡率；下调VEGF-A的表达。