建立高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系的研究

目的:建立一个组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。方法:(1)采用重组DNA技术将小鼠Retn基因的全长cDNA克隆到质粒pcDNA3的CMV启动子下面而获得一个能在真核细胞内组成性表达小鼠Resistin蛋白的表达载体pcDNA3-mRetn。(2)用电穿孔转染和G418筛选等方法建立能组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。(3)诱导细胞分化为脂肪细胞,并用实时荧光RT-PCR法分析这些脂肪细胞内Retn基因mRNA的水平。结果:构建了一个能在真核细胞内表达小鼠Retn基因的表达载体;建立了一个携带有pcDNA3-mRetn载体并组成性地高表达小鼠Retn基因的细胞系。结论:成功地建立了一个组成性地高表达小鼠Retn基因细胞系,为进一步研究Retn基因的功能和小鼠Resistin蛋白的获得奠定了基础。

小鼠Retn基因siRNAs的设计及其稳定表达载体的构建

目的 :设计小鼠 Retn基因特异性的 si RNAs,并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些 si RNAs的表达质粒 ,以便为在体外研究 Retn基因的功能打下基础。 方法 :(1 )设计并合成小鼠 Retn基因特异性的一组寡核苷酸片段 ,并克隆到 p Silencer EM 1 .0 - N eo载体 ;(2 )用电穿孔转染和 G4 1 8筛选等方法建立能稳定表达相应 si RNAs的一组 3T3- L1细胞克隆 ;(3)诱导细胞分化为脂肪细胞 ,并用 RT- PCR分析这些脂肪细胞内 Retn基因的 m RNA水平。 结果 :设计并构建了 4个小鼠Retn基因特异性的 si RNAs表达质粒 ,并证明其中的 2种质粒能在脂肪细胞内稳定表达相应的 si RNAs,显著地抑制了这些脂肪细胞内 Retn基因的 m RNA水平。 结论 :本研究设计并构建出的小鼠 Retn基因特异性的 si RNAs表达载体 ,所表达的 si R-NAs具有较强的 RNA干涉功能 ,为

Retn基因表达对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其机制探讨

目的:观察Resistin蛋白对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响并探讨其引发胰岛素抗性的可能机制。方法:(1)采用放射免疫测定法检测低、正常及高表达Retn基因的3T3-L1脂肪细胞在基础状态及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取水平。(2)采用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR法测定低、正常和高表达Retn基因的3T3-L1脂肪细胞中几种葡萄糖转运信号蛋白,包括胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)、丝/苏氨酸激酶2(AKT-2)、葡萄糖转运子4(GLUT-4)、丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)及糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的表达。结果:(1)在基础状态及胰岛素刺激下,3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取随Retn基因表达的升高而降低。(2)PI-3K和AKT-2两个信号蛋白mRNA的表达随着细胞内Retn基因表达水平的升高而降低;GSK-3β和p38MAPK两个信号蛋白mRNA的表达随着细胞内Retn基因表达水平的升高而升高。结论:(1)Resistin蛋白可以导致脂肪细胞产生胰岛素抗性,其机制可能与胰岛素信号通路中的PI-3K和Ras通路中一些信号蛋白表达的变化有关。