重组人纤维蛋白片段诱导CIK的增殖及对肺癌耐顺铂细胞的杀伤作用

为探讨重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)对CIK(Cytokine-induced killer cells)细胞活化、增殖的影响及CIK细胞的免疫学特性和对肺癌耐药细胞DDP-A549(DDP:Cisplatin)的杀伤作用。提取健康人外周血中单个核细胞,Ⅰ组细胞接种于前一天用RetroNectin和CD3MAb包被好的培养瓶中,Ⅱ组接种于单独用CD3MAb包被好的培养瓶中,接种当天加入IFN-γ,第二天加入IL-2诱导CIK细胞。细胞计数法测定CIK细胞的增殖,并绘制细胞生长曲线,MTT法测定细胞杀伤活性,流式细胞术分析细胞表型。扫描电镜和透射电镜下观察CIK细胞对DDP-A549的杀伤和DDP-A549细胞的改变。RetroNectin对CIK细胞有很强的激活作用,可使其细胞增殖总数达524.77倍,其主要效应细胞CD3+CD56+可达(31.40±1.91)%;对肺癌耐顺铂细胞DDP-A549的杀伤作用明显高于其亲代药物敏感株A549(P<0.01)。但两组CIK细胞对靶细胞的杀伤率在相同效靶比时无明显差异(P>0.05)。RetroNectin能显著增强CIK增殖活性,但对CIK细胞的杀伤活性并无明显影响。CIK能够显著抑制DDP-A549的生长,可用于耐顺铂肺腺癌的免疫治疗。

重组人纤维蛋白片段对CIK细胞增殖的影响及其可能机制研究

目的:探讨重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)对CIK细胞的增殖作用及其可能机制。方法:提取患者外周血单个核细胞,Ⅰ组细胞培养于前一天用RetroNectin和CD3m Ab包被好的培养瓶中,Ⅱ组培养于普通培养瓶中。第2天起按照常规CIK细胞培养方法分别培养,第14天收获。细胞计数法测定CIK细胞增殖;LDH法测定细胞杀伤活性;流式细胞术分析细胞表型并检测细胞周期;Annexin V/PI法检测细胞凋亡:封闭CD49d^+及CD49e^+后细胞计数法测定CIK细胞增殖;流式细胞术分析细胞表型;Western blot检测Vav1蛋白表达水平。结果:RetroNectin对CIK细胞增殖有明显促进作用(P<0.05),经RetroNectin包被后可以增加CIK细胞中CC25^+T细胞比例(P<0.05),对于结肠癌细胞系HCT-8 RN-CIK较CIK显示出了更强的杀伤活性(P<0.05),而对于白血病细胞系K562两组细胞杀伤活性无显著性差异(P>0.05)。RetroNectin可以将CIK细胞阻滞于G_1期而促进增殖,同时抵抗高活化细胞的凋亡。RetroNectin对CIK细胞中的CD49d^+CD49e^+T细胞亚群有明显上调作用(P<0.05)。拮抗CD49d/CD49e后RetroNectin对CIK细胞增殖作用消失(P>0.05),对CD25^+T细胞的上调作用也消失。Western blot结果显示Vav1蛋白表达与CD25^+T细胞变化相一致。结论:重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)能够通过调控细胞周期,抵抗凋亡而促进CIK细胞增殖,其机制可能为RetroNectin与CIK细胞上VLA-4及VLA-5两个位点结合进而通过Vav1蛋白作为第二信号活化T细胞。

重组人纤维连接蛋白对无血清培养的cik细胞增殖及对k562细胞杀伤活性的影响

目的探讨重组人纤维连接蛋白(RetroNectin,RN)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK增殖、免疫特性及对人类K562细胞杀伤活性的影响。方法密度梯度分离法分离外周血单个核细胞后分成两组,应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞,一组含RN(RN组),一组不含RN(Non-RN组)。记录两组细胞增殖速度;用流式细胞术动态测定免疫细胞表型;用CBA细胞因子试剂盒检测IFN-γ、TNF-α及IL-4的分泌;用CFSE/PI双标法测定CIK细胞对人红白血病细胞株(K562)的体外杀伤活性。结果 RN组细胞生长明显快于Non-RN组(P<0.05);CD3+CD8+的细胞随着时间的延长逐渐增多,但两组间比较无统计学差异;CD3+CD56+细胞所占百分比在第5天和第10天时两组间比较均无统计学差异(P>0.05),在第15天时RN组有大幅度升高,第15、20、25天两组比较均有统计学差异(P<0.05)。细胞毒杀伤活性结果显示,RN组与Non-RN组对K562细胞毒活性亦有统计学差异。两组间细胞因子IFN-γ、TNF-α随着培养时间的延长,分泌量逐渐升高。结论使用RN诱导的CIK细胞增殖速度快,杀伤肿瘤细胞活性高,是一种安全高效的细胞培养方法。

探讨地西他滨短时刺激对RAK细胞免疫表型及抗癌活性的影响

目的:探讨地西他滨(DAC)对重组人纤维连接蛋白活化杀伤细胞(RAK)增殖、免疫表型及抗肝癌效应的影响。方法:采用RetroNectin、CD3单抗及rhIL-2诱导外周血单个核细胞以培养RAK细胞,培养第1天加入不同浓度的DAC(0、50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L)刺激24 h后,全量换液。培养第4、7、10、12天,采用血球计数仪进行细胞计数,CFSE检测细胞增殖水平;流式细胞术检测不同培养时间各浓度DAC刺激的RAK细胞的免疫表型;Annexin-Ⅴ/PI检测细胞凋亡水平;以CD107a、IFN-γ、穿孔素、颗粒酶-B表达水平评估各组RAK细胞的抗肝癌效应。结果:随着培养时间延长,DAC浓度越高,细胞增殖抑制越明显(P<0.05)。与对照组相比,DAC短时刺激的RAK细胞在培养10 d后,高浓度DAC组(≥1 000 nmol/L)RAK细胞CD4比例显著增加,CD8比例及CD4+和CD8+的中央记忆细胞(TCM)比例呈下降趋势(P<0.05)。培养第12天NKT水平显著升高(P<0.05),随着DAC浓度增高细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)。与其他DAC浓度组相比,1 000 nmol/L DAC刺激组CD107a、IFN-γ、穿孔素表达显著升高(P<0.05)。结论:RAK细胞经1 000 nmol/L DAC短时刺激后,可提高CD4、CD4+TCM及NKT比例,增强对肝癌细胞的细胞毒效应。

重组人纤维连接蛋白对肝细胞肝癌患者自体CIK细胞体外扩增及生物学活性的影响

目的观察重组人纤维连接蛋白(RN)对肝细胞肝癌(HCC)患者细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)生物活性的影响,建立一种高效的CIK细胞体外扩增方法。方法取15份HCC患者外周血,分离单个核细胞,分别使用传统方法(抗CD3mAb+IFN-γ+IL-2)和RN法(RN+抗CD3mAb+IL-2)诱导,观察不同时间点两组细胞形态、数目、细胞表型和杀伤效率。结果与传统方法相比,RN组显著增加CIK细胞扩增倍数(P<0.05),是对照组的2.0～2.8倍,提高活化T细胞(CD25+T细胞)数量,增加CD3+CD8+T细胞比例,增强对肝癌细胞株的杀瘤活性。结论 RN能够高效促进HCC患者CIK细胞的扩增,可以替代传统方法。

重组人纤维连接蛋白对CIK细胞增殖和杀伤活性的影响

目的：研究并探讨重组人纤维连接蛋白（ RetroNectin ， RN ）对细胞因子诱导的杀伤细胞（ CIK）增殖、免疫特性及对人类K562、LOVO细胞杀伤活性的影响。方法提取患者外周血单个核细胞，标本分为四组，对照组（ CIK组）：按常规方法诱导CIK增殖；C－CIK组：提前通过CD3 Ab包被诱导；R－CIK组：提前通过RetroNectin包被诱导；R＋C－CIK组：提前通过RetroNectin及CD3 Ab包被诱导，记录各组免疫效应细胞不同时间段的增殖情况。流式细胞术检测各组细胞不同时间段的免疫表型变化；并用LDH法检测各组细胞对肿瘤细胞K562、LOVO杀伤活性。结果 R＋C－CIK组细胞增殖倍数高于其他三组，差异有统计学意义（ P＜0．05）；R＋C－CIK组及R－CIK组的CD3^＋CD56^＋双阳性细胞所占百分比较C－CIK及CIK组高，d12和d15时有统计学差异（P＜0．05）；在效靶比20∶1和40∶1时，R＋C－CIK及R－CIK组对K562的杀伤活性高于C－CIK及CIK组，杀伤活性有统计学差异（P＜0．05），R＋C－CIK组、R－CIK组及C－CIK组细胞对结肠癌细胞系LOVO的杀伤活性高于CIK 组，有统计学差异（ P＜0．05）。结论 RetroNectin联合抗CD3MAb包被技术应用于CIK体外培养可以获得增殖率和活性更高的免疫活性细胞，是值得临床推荐的一种有效的培养方法。

重组纤维连接蛋白诱导自体CIK联合IFN-α治疗晚期肝癌疗效

目的:探讨重组纤维连接蛋白(RN)诱导的自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞联合IFN-α治疗晚期肝癌的可行性。方法:分离14例晚期肝癌患者外周血单个核细胞,采用RN、CD3单抗、IFN-γ及IL-2等细胞因子诱导产生CIK。患者每周回输一次CIK,连续4～6次,同时给予IFN-α治疗。采用流式细胞术检测患者外周血淋巴细胞免疫表型,应用BDTM-CBAHumanTh1/Th2型细胞因子试剂盒监测治疗前及疗程结束后7d外周血细胞因子的变化。结果:每个患者平均回输细胞数为25.6×109(21.6×109～31.8×109),毒副作用小。治疗后患者外周血中淋巴细胞数,CD3+,CD3+CD56+,CD3+CD8+细胞数均有明显升高。14例患者中有1例获部分缓解,4例稳定,其中缓解和2例稳定患者的AFP水平明显下降。治疗后临床获益患者血清IFN-γ和TNF-α水平明显升高(t=12.644和17.169,P<0.001),而治疗无反应患者细胞因子水平则无明显变化。结论:RN诱导的自体CIK联合IFN-α治疗晚期肝癌是一种安全有效的过继免疫治疗方法。