IL-17和siRNA-IL-17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL-17的表达

目的构建含有Thy1.1细胞表面抗原(Thy-1.1cell surface antigen,Thy1.1)基因的携带IL-17或siRNA-IL-17基因的逆转录病毒载体,并观察逆转录病毒对致糖尿病性BDC2.5T细胞的转染能力。方法利用基因工程和细胞克隆技术分别将IL-17的cDNA插入MSCV-IRES-Thy1.1(MIT)逆转录病毒载体,将Thy1.1、U6增强子(U6promoter)基因和IL-17的siRNAcDNA插入逆转录病毒载体pMND-BANSHEE,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染293包装细胞;收集病毒上清,转染预先活化的NOD/BDC小鼠脾细胞,测定致糖尿病性T细胞的IL-17和siRNA-IL-17的表达。结果流式细胞术检测显示,成功构建携带IL-17和siRNA-IL-17的逆转录病毒载体。携带IL-17或siRNA-IL-17逆转录病毒分别感染原代培养并活化的NOD/BDC脾细胞,在空白对照组、空载体组、阳性对照组、IL-17组和siRNA-IL-17组,Thy1.1+/Thy1.2+细胞比例分别为(0.6±0.3)%,(7.2±2.4)%,(6.8±2.6)%,(6.4±2.4)%和(4.6±1.8)%;体外实验携带IL-17基因逆转录病毒转染BDC2.5T淋巴细胞后,IL-17的表达显著高于siRNA-IL-17转染组和未转染对照组(均P<0.01)。体外培养活化实验显示,携带IL-17逆转录病毒转染非活化组和活化组T淋巴细胞,转染后IL-17的表达均显著高于siRNA-IL-17转染组和未转染对照组(均P<0.01),其中IL-17转染活化组的IL-17的表达较非活化组更高(P<0.01);在siRNA-IL-17转染的非活化组和活化组,IL-17的表达显著降低,与未转染对照组相比无显著性差异(均P>0.05)。结论逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因IL-17或siRNA-IL-17转移至BDC/NODT细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。

淫羊藿苷经NF-κB信号通路干预大鼠免疫衰老的作用及机制

目的探讨中药延缓免疫衰老的作用和机制。方法清洁级健康雄性SD大鼠50只,分为4月龄(4 mon)、24月龄(24 mon)、24月龄加PDTC处理(24 mon+PDTC)、24月龄加Ica(icariin,Ica)干预(24 m+Ica)和24月龄加Ica干预再加PDTC处理(24 mon+Ica+PDTC)五组,每组10只。自21月龄满开始,24 mon+Ica组和24 mon+Ica+PDTC组大鼠予Ica灌胃,24 mon组和24 mon+PDTC组给予等量蒸馏水灌胃,均连续3个月。24 mon+PDTC组和24 mon+Ica+PDTC组大鼠在灌胃结束前1 w每2 d腹腔注射PDTC,按200 mg/kg体重分2次注射。处死大鼠分别提取大鼠脾CD4+T淋巴细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,电泳迁移率(EMSA)检测细胞NF-κB的活性,Western印迹法检测细胞P65蛋白表达水平。结果 24 mon组大鼠脾CD4+T淋巴细胞凋亡率明显高于4 mon组和24 mon+PDTC组(P<0.05),而24 mon+Ica组细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与24 mon+PDTC组比较,24 mon+Ica+PDTC组脾CD4+T淋巴细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与4 mon组大鼠相比,24 mon组大鼠脾CD4+T淋巴细胞中p65蛋白表达显著下调(P<0.01);与24 mon组比较,24 mon+Ica组p65蛋白表达明显上调(P<0.01),24 mon+PDTC组则显著下调(P<0.05)。与24 mon+PDTC组比较,24 mon+Ica+PDTC组p65蛋白表达明显增强(P<0.05)。24 mon组大鼠脾CD4+T淋巴细胞NF-κB的活性明显低于4 mon组(P<0.01);与24 mon组比较,24 mon+Ica组NF-κB的活性增强(P<0.01),24 mon+PDTC组NF-κB活性则降低(P<0.01)。相关分析表明,CD4+T淋巴细胞NF-κB活性与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.75,P<0.01)。结论 NF-κB通过抑制淋巴细胞凋亡参与免疫衰老的调控;Ica可能通过提高NF-κB的活性和诱导P65高表达来抑制淋巴细胞过度凋亡从而延缓免疫衰老。