EIAV Rev核输出活性检测系统的建立

Rev蛋白是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白,它与病毒mRNA的特定序列结合,将编码病毒结构蛋白的mRNA运输至胞浆,从而促进病毒结构蛋白的表达,将Rev介导病毒mRNA核质运输的生物学功能简称为核输出活性。为建立马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev的核输出活性检测方法,本研究通过PCR方法克隆了EIAV的结构蛋白Gag-Pol编码区序列及Rev反应元件(RRE)序列,构建pGagpol-RRE表达载体,将其单独或与Rev表达载体(pcDNA-Rev _(FDDV)-HA)共转染HEK293T细胞后,通过western blot分析显示,pGagpol-RRE单独转染HEK293T细胞不表达,须在Rev的作用下才能在HEK293T细胞中表达,而且Gag的表达量随着Rev剂量(0.05μg、0.1μg、0.2μg)的增加而增加。在pcDNA-Rev _(FDDV)-HA的基础上,通过PCR方法将Rev核输出活性的关键位点L^(36)突变成A,构建突变的Rev表达载体pcDNA-Rev _(L36A)-HA,将其与pGagpol-RRE共转染HEK293T细胞后,经western blot检测结果显示,未检测到Gag的表达。上述结果表明表达载体pGagpol-RRE可以用于评价EIAV Rev的核输出活性。在此基础上,本研究将不同EIAV的Rev表达载体与pGagPol-RRE共转染HEK293T细胞,经western blot鉴定结果显示,不同EIAV的Rev均可以介导Gag-Pol的表达。上述结果表明,表达载体pGagpol-RRE转染细胞后经western blot检测Gag表达量的变化可以广泛用于评价不同EIAV Rev的核输出活性。本研究利用Rev与RRE结合介导Gag-Pol表达的原理首次建立了EIAV Rev核输出活性检测系统,为进一步研究Rev的生物学活性奠定了基础。

粗糙集算法在预测RNA保守功能二级结构中的应用

提出了一种预测RNA保守功能二级结构的粗糙集算法.使用粗糙集工具Rosetta软件,在保守结构预测过程的数据挖掘模块中,应用经过整理和离散化的RNA备择碱基对数据生成规则确定出将要出现在同源RNA序列的保守二级结构中的碱基对.将此算法应用在对爱滋病病原体HIV病毒RNA中REV应答元件单元的保守二级结构预测的结果表明,与传统的非数据挖掘算法相比,使用了这种机器学习算法的粗糙集预测方法,使得保守功能结构与野生型结构更加相似,重要的功能结构分支更加清晰明确.

HIV－1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件

目的研究HIV-1载体中的一些元件如Rev和Tat蛋白对其骨架的转录及外源基因表达水平的影响。方法将HIV-1表达GFP载体（FUGW）单独或分别与Rev蛋白表达质粒（pLP2）、Tat蛋白表达质粒（pcDNA3.1-Tat），及表达Rev和Tat蛋白的质粒（△8．9）等摩尔共转染人293T细胞后，经实时定量RT-PCR、FACS、荧光显微镜镜检等方法检测，比较其表达量。结果Rev与RRE结合后，载体骨架及外源基因的转录是单独转染FUGW时的3倍，Tat与TAR结合后，则提高其骨架及外源基因的转录近4倍，而Rev和Tat蛋白的协同作用，其转录本则可提高至6倍。FACS和荧光显微镜镜检也显示GFP蛋白表达量明显提高。F-TPO载体（HIV-1载体乳腺特异表达促血小板生成素）与△8．9在小鼠乳腺上皮细胞HC-11共转染和表达，则TPO蛋白的表达量接近pcDNA3．1-TPO载体的8倍。结论HIV-1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件，可提高其骨架的转录和外源基因的表达，且该现象并不依赖于细胞类型和外源基因的种类。