Rev依赖性人类免疫缺陷病毒检测结构的合成与表达

目的 利用人类免疫缺陷病毒 (HIV)低变异的调节蛋白Rev与Rev反应区 (RRE)的高亲和性 ,尝试合成一种不受变异影响的特异性病毒表达检测结构。方法 采用分子克隆技术合成含有RRE和增强的绿荧光蛋白 (EGFP)的Rev依赖性荧光表达质粒 ,采用流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果 新合成的质粒pDM 12 8 EGFP (pE12 8)含氨苄青霉素受体 (AmpR)选择子、SV40 启动子、EGFP基因及HIV 1 RRE片段 ,BssSI酶切后产生 3 .6、1.9和 1.5kb片断 ,HindⅢ酶切后产生 3 470、2 72 5和 879bp 3个片断 ,PCR扩增提示EGFP基因完整插入。pE12 8在Hela细胞中显示Rev依赖性表达 ,pRev不存在时 ,几乎没有EGFP表达 ;pRev存在时 ,EGFP显著表达 (P <0 .0 1)。绿荧光Hela细胞百分比随pRev比例的增加而渐次增加。结论 pE12 8能特异、敏感、快速和直观地检测HIV的表达 ,对反映HIV的感染性及病情的转归及对获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)

人类免疫缺陷病毒感染细胞的Rer蛋白依赖性凋亡引导

目的:以人类免疫缺陷病毒(HIV)调节蛋白Rev与Rev反应区(RRE)的高亲和性建立引导HIV感染细胞凋亡的结构。方法:用分子克隆技术合成含RRE和肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)的Rev依赖性凋亡引导质粒,流式细胞仪检测质粒表达。结果:新质粒pDM128-TNF-R1(pT128)HindIII内切有3.1、2.7、1.0和0.87kb片段;聚合酶链反应(PCR)法检测示TNF-R1的1360bp片段。DNA测序法确认其准确性。单纯Hup60TNF-R1在pDC302(pT60)转染Hela,TNF-R1表达可明显杀伤Hela(P<0.01),Rev存在时,pT128也能表达TNF-R1杀伤Hela(P<0.01),但不及pT60的作用(P<0.01);无Rev时,pT128不表达TNF-R1,不杀伤Hela(P>0.01)。单纯Rev不杀伤Hela(P>0.01)。pT128与pRev共转,TNF-R1表达较pT60慢(P<0.01),40h后才接近单纯pT60。结论:新质粒具有Rev依赖性表达作用,进而引导Rev表达细胞凋亡。