丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针，建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法，同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较，发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ，但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断，可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性，以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制，打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化，对治疗的评价，以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。

利用外源RNA作为内参结合qPCR准确检测SF2蛋白RIP富集RNA的效率

利用实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测0.1%甲醛交联RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)富集SF2蛋白相互作用的RNA效率,为研究可变剪接因子SF2相互作用RNA的富集效率提供准确的质检方案。采用RIP技术获取He La细胞中SF2蛋白相互作用的RNA,等比例加入外源酿酒酵母(BY4741)RNA,并以其β-actin作为内参基因,利用q PCR检测RIP富集SF2蛋白相互作用RNA的效率。结果显示,0.1%甲醛交联RIP技术特异性捕获得到SF2蛋白-RNA复合物;q PCR技术检测阳性基因PABP、Srsf1在SF2抗体捕获的产物和Ig G抗体的产物中相应RNA的浓度差异均在60倍以上。利用q PCR技术,以外源酿酒酵母(BY4741)RNA作为内参,能快速、准确定量检测RNA的富集效率。

干种子高质量总RNA的快速提取方法

高效快速提取高质量的种子RNA是种子分子生物学研究的基础。现有的提取方法难以高效快速地从种子中得到高质量的总RNA。本试验有机地将改进SDS法和异硫氰酸胍法相结合,采用改进的酸性SDS提取液、不溶性PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)阻止酚类氧化、KAc去除多糖、异丙醇沉淀RNA,可以高效地从0.01～0.1g水稻、大豆、蚕豆、芸豆、花生等干种子中提取到高质量总RNA。此法提取的总RNA,能够满足分子生物学研究的要求,可以进行反转录和RT-PCR反应,用于基因表达研究,并为从具相似成分的其他物种干种子提取总RNA提供参考方法。

富含多糖的植物组织miRNA提取方法的改进

目的:建立冻融法结合小分子RNA分离试剂盒简便快速提取富含多糖的植物组织miRNA的方法。方法:利用乙醇/醋酸钾沉淀法、小分子RNA分离提取试剂盒标准步骤提取方法和结合反复冻融法改进的小分子RNA分离提取方法分别提取玉米胚乳组织小分子RNA,通过小分子RNA浓度、纯度及完整性检测,以及内参5s rRNA扩增验证模板真实性等比较3类方法小分子RNA的提取效果。结果:乙醇/醋酸钾沉淀法易丢失大量小分子RNA;小分子RNA分离提取试剂盒标准步骤提取所获小分子RNA浓度、纯度较低,富含大量多糖杂质;反复冻融法结合小分子RNA分离试剂盒提取的小分子RNA浓度、纯度较高,有效去除多糖杂质,内参5s rRNA扩增验证真实性表明其所获miRNA的cDNA模板质量较高。结论:结合反复冻融法和小分子RNA分离试剂盒,可以简便快速去除多糖内杂质,保证小分子RNA完整性,加尾及引物延伸RT-PCR、所获miRNA的cDNA模板质量较高,可用于后续miRNA实验研究。

果树组织中总RNA提取的新方法

本研究设计了一种新的RNA提取方法 ,解决了RNA提取时容易被降解和污染这一关键问题。通过加入Rnase抑制剂 ,消除了同外源RNase对RNA的降解 ,结合DNA难呈低盐溶液(140mmol·L -1NaCl)的原理 ,去除了DNA对RNA提取液的污染 ;先后使用酚和氯仿 ,有效地去除了蛋白质和酚类物的污染 ,利用抗氧化剂PVP和巯基乙醇 ,消除了内源酚类物质氧化变色对病毒RNA逆转录的影响。采用上述方法可以在4～5h内得到纯度高、含量大、完整性好的果树总RNA ,并获得了逆转录活性较强的病毒RNA ,同时使提取RNA的成本降低。这些方法对苹果、葡萄、桃、樱桃等果树总RNA的提取均适用。

实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法,初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性. 方法:HCV抗体阳性样本80例,包括慢性肝炎(CH) 39例,肝硬化(LC)23例,肝癌(HCC)18例,献血员样本40例为正常对照.在HCV基因组5’非编码区(5’UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析. 结果:本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L,批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29,7.86±0.32 vs 4.67±0.41,P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.89, t=8.29,P<0.05). 结论:RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性,其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性.

长链非编码RNA MEG3在胃癌中的表达及其与预后的关系

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在胃癌组织中的表达及其与预后的关系,并进一步探讨MEG3与凋亡相关蛋白P53、鼠双微基因2(murine double minute 2,MDM2)的相关性。方法:收集2012年9月至2013年6月青岛大学附属青岛市市立医院55例行手术治疗的胃癌切除标本(包括癌组织及对应的远端正常组织),实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测胃癌组织中MEG3的表达,并分析其与临床病理参数的关系;应用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测胃癌中P53、MDM2蛋白的表达水平,并分析其与MEG3的相关性。结果:lnc RNA MEG3在胃癌组织的相对表达水平(7.98±0.19)低于所对应的正常组织(9.47±0.18,P<0.05);在胃癌组织(r=-0.627,P<0.001)及远端正常组织(r=-0.807,P<0.001)中,P53与MDM2的表达呈负相关;P53与MEG3的表达呈正相关(r=0.591,P<0.05),MDM2与MEG3的表达呈负相关(r=-0.346,P<0.05);MEG3高表达者较低表达者中位生存期明显延长。结论:MEG3在胃癌发生发展过程中起抑癌基因的作用;MEG3与P53、MDM2在胃癌发生发展的生物学机制上有重要联系;检测MEG3的表达水平对胃癌预后有潜在价值。

油茶总RNA的提取与内参基因的初选

为得到高质量的油茶总RNA及稳定的内参基因,以油茶良种‘华硕’为试验材料,采用ambion试剂盒结合CTAB法进行总RNA提取。获得的总RNA完整性好,纯度高;从前期构建的油茶转录组数据中选取ACT(肌动蛋白基因)等14个基因作为候选内参基因,共设计22对引物,通过RT-PCR反应体系的优化及琼脂糖凝胶电泳检测,快速筛选出了适合油茶不同组织(器官)的内参基因。ALB(清蛋白基因),EF1α(延伸因子基因),ETIF3H(启动因子基因),UBC2(泛素结合酶基因)可以作为油茶果实初选内参基因,EF1α可以作为油茶根、茎、花及果实内参基因,ETIF3H可以作为油茶根、茎、叶、花瓣的内参基因。

RNAi沉默STAT3基因对人宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭的影响

目的:探讨信号转导因子与转录激活因子3(STAT3)短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭能力的影响。方法:针对人STAT3的基因设计并合成编码小干扰RNA(siRNA)的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,构建STAT3基因shRNA真核表达质粒,脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)法分别检测STAT3基因的mRNA及蛋白表达水平;软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测SiHa细胞的定植和侵袭能力。结果:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体成功地转染人宫颈癌SiHa细胞,细胞STAT3蛋白及mRNA表达均下降(P<0.05);SiHa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少(P<0.05)。结论:STAT3基因shRNA真核表达载体通过下调STAT3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力。

利用Taq DNA聚合酶直接从双链RNA模板中扩增靶序列

利用Taq DNA聚合酶既具有DNA聚合酶活性义具有反转录酶活性的特点,探索了在Taq DNA聚合酶单独作用下以双链RNA为模板进行PCR反应的条件。结果表明靶序列长度为277 bp、369 bp、987 bp时,均可直接进行PCR扩增;短片段序列扩增的退火温度在47．0℃、47．9℃、50．2℃、52．6℃、54．9℃、56．7℃条件下,均可有效扩增,而长片段序列扩增的退火温度在50．2℃、52．6℃、54．9℃、56．7℃条件下,也可扩增出相应的靶序列。这一结果提示利用Taq DNA聚合酶可以dsRNA为模板直接扩增目的片段,尤其是短片段的扩增。

靶向RNAi对Mc3细胞中Survivin mRNA表达及细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰技术靶向阻断Survivin基因表达，观察其mRNA表达水平及细胞增殖的变化，探讨其对Me3细胞的抑制作用。方法将RNA干扰表达载体Pgenesil—sur通过脂质体介导转染Mc3细胞，采用半定量PCR检测Survivin mRNA表达量；MTT法检测对黏液表皮样癌细胞的增殖抑制作用。结果RNA干扰组Survivin mRNA表达水平（0．61±0．10）比对照组Survivin mRNA表达水平（3．20±0．11）显著减低，差异有统计学意义（P〈0．01），转染Pgenesil-1空载体组Survivin mRNA表达水平（3．18±0．12）与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．0S）。MTT结果表明转染Pgenesil—sur后细胞增殖受到明显抑制，抑制率达81％；转染Pgenesil-1空载体细胞未受到抑制。结论靶向Survivin RNA干扰能阻断肿瘤细胞中Survivin基因mRNA表达，并有效抑制体外培养的Mc3细胞的增殖作用。

富勒烯(C_(60))对RNA逆转录的影响

目的:研究富勒烯(C60)对RNA逆转录(Reverse Transcription,RT)反应的影响。方法:以斑马鱼鱼肝mRNA为模板,在M-MLV逆转录酶作用下合成cDNA,并在RT反应体系中添加不同浓度的C60,分别研究C60对M-MLV逆转录酶和RNA构象的影响。结果:100μg/mL C60可显著抑制RT反应,抑制效应与C60浓度相关,但增加M-MLV逆转录酶量可以有效逆转C60对RT的抑制作用。C60与RNA在37℃避光孵育12 h后,C60可特异降解28S rRNA,同样具有浓度依赖性。结论:C60不仅可显著抑制M-MLV逆转录酶活性,而且对RNA也具有一定的损伤作用,C60具有潜在的基因毒性。

少白细胞血小板miRNA提取方法

目的:建立常规梯度离心结合MACS磁珠分选纯化和小分子RNA分离试剂盒简便快速提取血小板miRNA的方法。方法:利用常规梯度离心获取血小板后,结合MACS磁珠分选和小分子RNA分离试剂盒提取少白细胞血小板(LDP)小分子RNA;经血小板计数、CD45和GPIIb mRNA marker PCR扩增检测,判定纯化效果;通过小分子RNA浓度、纯度及毛细管电泳完整性检测,以及内参U6和血小板miR-449b加尾及引物延伸RT-PCR后PCR扩增结果验证构建血小板miRNA的cDNA模板真实性。结果:提取小分子RNA纯度较高,有效去除白细胞污染,虽然含量较少,但内参U6和血小板miR-449b真实性验证结果提示,构建血小板miRNA的cDNA模板质量较高。结论:常规梯度离心结合MACS磁珠分选纯化和小分子RNA分离试剂盒,可有效去除白细胞污染,保证小分子RNA完整性,从而提取高质量血小板miRNA的cDNA模板,可用于后续血小板miRNA试验研究。

血清中不同基因型丙型肝炎病毒RNA含量的测定

目的了解血清中不同基因型丙型肝炎病毒HCVRNA的含量。方法用实时荧光定量RTPCR和逆转录型特异性引物PCR同时检测21例费城酒精依赖丙肝患者的血清HCVRNA拷贝数并分析HCV基因型。结果21份血清标本中,有17份为HCVRNA阳性。这些阳性血清的HCVRNA含量波动范围在104.60～106.20拷贝/ml。检测到1a和1b两种HCV基因型,其中1a型7例,RNA平均滴度为105.28±0.75拷贝/ml,1b型(9例)RNA平均滴度为105.28±0.28拷贝/ml。结论定性和定量检测结果有极佳的一致性,酒精依赖丙肝基因型1a和1b血清中HCV含量无显著性差异。

实时逆转录聚合酶链反应定量检测人TNF-α mRNA的表达

目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达 TNF-α mRNA 的方法。方法根据 Gene Bank 中 TNF-α mRNA 序列和 MGB 探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人 TNF-α mRNA 的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后进行 TNF-α表达检测。结果本法灵敏度为10~3拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(10~3～10~9拷贝/毫升);特异性好,PCR 产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以 Ct 值计算变异系数(CV 值),批内批间 CV值均小于5%;10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后 TNF-α mRNA 的平均含量分别为10^(4.15±0.49)和10^(5.19±0.43)拷贝/毫升。结论Taqman-MGB 实时荧光 RT-PCR 定量检测人 TNF-α mRNA 表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值。

肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较

该文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量PCR(q-RT-PCR)的方法。比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(OligodT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶(Taq聚合酶、Pfu聚合酶、LAtaq聚合酶、Prime Star聚合酶)进行长片段基因克隆的能力及效率;同时,该研究比较了不同质量总RNA对有效进行q-RT-PCR与长片段分子克隆的影响。新建立的RNA提取方法使得RNA完整性和均一性提高。RNA的完整性及均一性对长片段cDNA的克隆至关重要。部分降解的组织RNA及细胞RNA仅适合于q-RT-PCR检测mRNA的表达水平,而不适合于cDNA的克隆。

四种提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA方法的比较

目的比较四种联合提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA的方法。方法使用Trizol法、磁珠法、Qiagen^(TM) RNA Mini Kit和柱式RNA抽提试剂盒分别提取诺如病毒和副溶血性弧菌的总RNA,经核酸测定仪检测RNA的质量,并用RT-PCR法对四种提取方法进行比较。结果 Qiagen^(TM) RNA Mini Kit的提取效率最佳,对PCR的反应影响最小。磁珠法其次,但是磁珠法提取出的总RNA纯度也较高。Trizol法和柱式法总RNA抽提试剂盒所获得的总RNA比上述两者低,且存在不同程度的污染。经随机区组方差分析显示,四种提取方法之间存在显著性差异,F浓度=11.313;F(A_(260)/A_(280))=15.093;F(A_(260)/A_(280))=11.155,P均<0.05。结论四种试剂的实际提取效率存在差异,应根据不同的样本情况选择合适的试剂。

胃癌及癌前病变组织中端粒酶RNA表达及其临床意义

目的 探讨胃癌及癌前病变胃粘膜端粒酶 RNA与端粒酶活性检测及临床意义。方法 分别采用原位逆转录— PCR、端粒重复序列扩增法 (TRAP)检测 114例胃粘膜组织标本端粒酶 RNA与端粒酶活性 ,其中包括慢性浅表性胃炎 (CSG) 32例、不典型增生 (AH) 34例、胃癌 (GC) 4 8例。结果 原位逆转录— PCR检测胃粘膜活检标本的端粒酶RNA阳性率为 5 7.9% (6 6 / 114) ,显著高于 TRAP法检测端粒酶活性检出率 (4 4.7% ,5 1/ 114,P<0 .0 5 )。在不同胃粘膜病变中 ,AH及 GC组的端粒酶 RNA阳性率分别为 5 2 .9%、10 0 % ,而 CSG组胃粘膜中未检出端粒酶 RNA;AH及 GC组的胃粘膜端粒酶 RNA阳性率分别显著高于 CSG(P<0 .0 5 ) ,而 GC组端粒酶 RNA阳性率亦明显高于 AH组 (P<0 .0 5 )。端粒酶 RNA主要分布于胃粘膜癌细胞及癌前病变上皮细胞的胞核内。结论 端粒酶 RNA表达与胃癌的发生密切相关。原位逆转录— PCR检测胃粘膜端粒酶 RNA可能是较端粒酶活性更灵敏的生物学指标 。

28098名献血者HCV-RNA检测及部分阳性者的随访调查

目的评价逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测献血者HCV-RNA的意义,调查献血者HCV感染的“窗口期”情况。方法用RT- PCR检测大批正常献血者的HCV- RNA,并对其中部分HCV -RNA阳性者做随访研究。结果在28098名常规化验项目均正常的献血者中,HCV-RNA阳性77人,占0.27%,对11名HCV -RNA阳性献血者跟踪,其中9例在随访检查的常规项目中,ALT和(或)抗HCV均出现不正常,出现的时间距首次HCV -RNA阳性至少4周。结论RT- PCR检测血液HCV- RNA能早期发现HCV感染者,为提高输血安全性,宜在献血者中开展HCV-RNA检测。