RhD双群患者的血清学及分子生物学分析--附1例报道

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对患者血浆进行不规则抗体筛选及鉴定以及交叉配血试验;采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测RHD基因合子型,采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD和RHCE基因型检测。结果血型鉴定的结果显示该患者血型为B型,RhD及RhCE的c和E血型抗原均为DP,直抗阳性,抗体筛查及鉴定结果显示血浆中含有抗-D;PCR-RFLP结果显示该患者RHD基因盒子型为D-/D-纯合子,即为RHD编码基因缺失型所致的RhD阴性;PCR-SSP的结果也显示该患者RHD编码基因外显子均缺失,RHD基因型为RHD*01N.01/01N.01,RHCE基因型为Ccee。结论本例患者在急救情况下输注了RhD阳性血液,之后被误判为RhD阳性血型,实则为RhD阴性血型。本中心在血型鉴定为DP时,利用分子生物学方法对患者进行了Rh血型准确鉴定,为该患者的精准临床用血提供了依据。

广西地区RhD阴性无偿献血者血型分布调查

目的:了解广西地区RhD阴性献血者中ABO血型和RhC、c、E、e抗原分布情况,以便建立RhD阴性献血者档案和指导RhD阴性献血者血液的保存利用。方法:对RhD初筛阴性的标本,用IgG抗-D试剂做试管法间接抗球蛋白试验进行确认,C、c、E、e 4种Rh系统抗原检测采用盐水试管法,并采用正反定型对ABO血型进行鉴定。结果:分析广西地区10家血站共5480例RhD阴性献血者资料,5480例RhD阴性献血者中ABO血型分布情况为O型2393例,占43.67%;A型1412例,占25.77%;B型1345例,占24.54%;AB型330例,占6.02%。10家血站共有5家血站对RhD阴性献血者进行了C、c、E、e 4种Rh系统抗原检测,占比50.00%。5480例RhD阴性献血者中3776例进行了C、c、E、e 4种Rh系统抗原检测,占比68.91%。3776例RhD阴性献血者C、c、E、e抗原分型分布情况为ccdee 1794例,占47.51%;ccdEe 103例,占2.73%;ccdEE 7例,占0.19%;CcdEe 69例,占1.83%;Ccdee 1458例,占38.61%;CCdee 338例,占8.95%;CCdEe 5例,占0.13%;CcdEE 1例,占0.03%;CCdEE 1例,占0.03%。结论:对献血者RhD阴性血型进行确认时,应同时进行C、c、E、e 4种Rh系统抗原检测,并建立稀有血型档案库,对有效利用RhD阴性血液、提高输血的安全性具有重要意义。

输血相容性检测实验室RhD血型检测策略专家共识

RhD抗原是Rh血型系统最具免疫原性的抗原,可导致溶血性输血反应(HTRs)和胎儿与新生儿溶血病(HDFN)。我国RhD阴性红细胞属于稀缺资源,RhD阴性患者及时输注红细胞面临资源挑战。对于初筛(盐水法)为RhD阴性的不同人群,使用何种检测策略、如何出具检测报告、何时需要鉴定“亚洲型”DEL(RHD*01EL.01,c.1227G>A)是临床输血工作者较为困惑的问题。本共识由国内200余位输血相容性检测技术专家进行深入探讨后完成,旨在进一步规范、细化RhD血型检测策略,为实现不同RhD血型患者精准输血,不断提高RhD-HTRs及RhD-HDFN的防治水平提供技术支撑,为今后制定RhD血型检测策略行业标准奠定基础。

RHD*845A/1227A变异型个体的分子机制

目的:研究1例罕见的RhD变异型个体的基因突变机制。方法:采用常规血清学方法对样本进行Rh分型,间接抗人球蛋白试验确认RhD抗原以及抗体筛查。D-screen试剂分析样本的RhD抗原表位。利用序列特异性引物聚合酶链反应法检测RHD基因以及RhD杂合型分析,Sanger测序方法分析RHD基因编码区序列。应用逆转录聚合酶链反应检测样本RHD mRNA,对RHD cDNA进行TA克隆和序列分析。结果:血清学检测该样本RhD抗原为弱阳性,Rh分型为CcDEe,抗体筛查结果为阴性。经D-screen试剂检测样本表现出部分D的抗原表位分布。经RHD基因编码序列分析发现,RHD基因第6外显子第845位和第9外显子第1227位碱基均显示G/A杂合。TA克隆得到3种剪接异构体。结论:该研究对象为RHD基因845G>A和1227G>A突变个体,该杂合突变导致样本红细胞RhD抗原减弱。

RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL型红细胞短期内引起高效价抗-D的同种免疫研究

目的通过对1例RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL红细胞后诱发同种抗-D免疫的研究分析,探讨RhD阴性患者输注DEL型策略。方法采用血清学方法进行ABO及Rh系统血型抗原检测、不规则抗体筛查及鉴定,高分辨熔解曲线和基因测序分析检测DEL型的RHD基因分型。结果受血者为O型,RhD阴性。供血者为RHD 1227G>A突变的“亚洲型”DEL,Rh表型为Ccee。受血者输血后抗体筛查阳性,并鉴定为抗D和抗C,抗D效价512,抗C效价128。结论RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL红细胞会引起抗-D同种免疫。因此对于RhD阴性献血者应加强DEL型的筛查,必要时可以增加RHD基因检测以保障输血安全。

RhD血型不匹配异基因造血干细胞移植输血RhD血型选择

RhD血型不匹配异基因造血干细胞移植在我国发生率很低,同时匮乏的RhD阴性血液资源难以满足这一类患者的输血需求。作者梳理了RhD血型不匹配的造血干细胞移植时RhD血型输血选择、临床预后及预防同种抗体产生方法的文献,以期为这类患者输血尤其是应急情况下输血时RhD血型选择提供依据。

探讨产前及输血前检测孕产妇ABO与RhD血型的临床意义

目的探讨产前及输血前检测孕产妇ABO与RhD血型的临床意义。方法选取80例进行体检的孕产妇,所有孕产妇均进行血型鉴定,并完成不规则抗体检测,观察其检验结果。结果80例孕产妇中,不规则抗体阳性有12例(15.00%),包括有妊娠史的孕产妇8例和输血史的孕产妇4例。12例不规则抗体阳性结果的孕产妇中A型血有3例(25.00%),B型血有3例(25.00%),O型血有5例(41.67%),AB型血有1例(8.33%)。其中,RhD阳性占11/12(91.67%),抗E占比最高,为5/12(41.67%),抗Ec占2/12(16.67%),抗D占2/12(16.67%),抗C占1/12(8.33%),抗c占1/12(8.33%)。结论在产前和输血前为孕产妇实施不规则抗体、ABO和RhO血型检测,可为临床上明确母婴血型的不匹配和易流产情况或新生儿溶血病等提供依据,以尽早加以筛查和处理,具有重要的检验指导性意义。

2021—2022年广州地区献血人群ABO血型筛查结果分析

目的 了解广州地区无偿献血者ABO、RhD血型的分布情况,为保证临床用血安全和更好为献血者服务提供依据。方法 对2021年1月—2022年12月的无偿献血者进行常规ABO、RhD血型检测,统计分析ABO血型构成比,对ABO正反不一致血型、RhD初筛阴性的标本进行血型血清学确证,分析ABO亚型检出情况及漏检原因。结果 2021年1月—2022年12月共筛查献血者标本749 123份,剔除重复献血者后的标本513 291份,其中ABO血型分布为:O型208 126份(40.55%)、A型138 859份(27.05%)、B型130 987份(25.52%)、AB型35 319份(6.88%)。ABO血型初筛正反不一致506份,其中弱/无红细胞反应58份、额外的红细胞反应16份、弱/无血清反应215份、额外的血清反应217份;经血型血清学或分子生物学确认ABO亚型44份,其中A亚型13份、B亚型26份、AB亚型5份;B(A)3份;类孟买血型14份。重复献血者漏检率最高的血型是A_3/B_3类亚型(68.42%)。在513 291份标本中共检出意外抗体阳性128份;RhD血型初筛阴性共2 277份,其中RhD阴性确认2 188份[2 188/513 291(0.43%)],RhD变异型89份[89/513 291(0.02%)],合并检出意外抗体30份[30/2 188(1.37%)]。结论 广州地区献血人群ABO分布O>A>B>AB,RhD阴性人群占比为0.43%,略高于全国汉族人群0.3%~0.4%;ABO血型亚型以B亚型为主;A_3/B_3类亚型的检出率及在常规血型检验中漏检率最高。

秀山县3个主要民族无偿献血者ABO、RhD血型的调查

目的 为了解秀山县3个主要民族无偿献血者的ABO血型、RhD血型和基因频率,更好的制定无偿献血计划。方法 选取2012年-2019年秀山县汉族、土家族、苗族无偿献血者,剔除不符合要求的数据,利用Bernstein校正公式和赵桐茂方法计算p、q、r基因频率,|t|≤2时,P≥0.5作为无显著差异界限,检验Hardyweinberg平衡度;一般资料采用微软EXCEL 2003函数计算,组间比较采用SPSS 24.0卡方检验,P<0.05有统计学意义。结果 本次共调查9664人,汉族、土家族、苗族3个主要民族的血型表现型为O型>A型>B型>AB型,基因频率r>p>q,民族指数均>1,|t|<2,P>0.5,均满足Hardy-weinberg平衡;湘西州汉族、黔江土家族与秀山汉族、土家族比较无统计学意义(P>0.05),太原汉族、湘西州土家族、柳州苗族、湘西州苗族与秀山3个民族比较比较有统计学意义(P<0.05);RhD阴性率0.16%,不同RhD血型的ABO血型比较无统计学意义(P<0.05)。结论 秀山县汉族、土家族、苗族人群ABO血型分布和基因频率保持稳定,RhD阴性频率偏低。

全自动微柱凝胶技术在ABO、RhD血型鉴定中的应用研究

目的探讨全自动微柱凝胶技术在ABO、RhD血型鉴定中的应用。方法采用全自动微柱凝胶技术对5150例标本进行ABO及RhD血型鉴定,并与纸板法进行比对实验。对实验中出现因ABO正反定型不一致而无法定型的标本改用试管法,并增加吸收放散实验、唾液型物质抑制实验及H抗原强度检测以确定最终血型。结果5150例标本中全自动微柱凝胶法ABO血型一次准确定型率为99.9%(5145/5150),纸板法ABO血型一次准确定型率为99.7%(5135/5150),两种方法比较有显著性差异(P﹤0.05);全自动微柱凝胶法RhD血型一次准确定型率为100%(5150/5150),纸板法RhD血型一次准确定型率为99.9%(5146/5150),两种方法比较无显著性差异(P﹥0.05)。全自动微柱凝胶法发现疑似亚型标本1例,经进一步实验确认为A3亚型。结论全自动微柱凝胶技术安全、可靠,较纸板法更为灵敏,易于发现亚型;实现了实验操作规范化、标准化,降低了人为错误的发生率;实验结果可永久保存,便于查询和医疗举证。

等候肾移植患者中RHD阴性血液样品的基因分型及意义

目的探讨等候肾移植患者中RHD阴性血型基因血清学与分子生物学的差异。方法收集2006年1月~2016年1月广州市各器官移植中心等候肾移植的患者中经血清学检测为Rh D阴性的血样103例,采用分子生物学方法(定量PCR-测序技术)进行RHD基因分型。血清学与分子生物学两种方法对Rh D假阴性检出率行χ2检验。结果 103例血样中,Rh D真阴性(即10个外显子全部缺失)56例(54.5%),Rh D假阴性(即Rh D阳性,但是10个外显子中有部分缺失、重复、错义突变)47例(45.6%)。在47例Rh D假阴性中,弱D(weak D)1例(2.1%)、部分D(partial D)13例(27.7%)、放散D(D-elution)33例(70.2%)。血清学与分子生物学对Rh D阴性识别的差异呈统计学显著性(P<0.05)。结论 103例血清学检测出的Rh D阴性中有45.6%通过分子生物学方法检测实际为Rh D阳性变异体,说明血清学技术对识别Rh D阴性呈较高错误率。利用分子生物学技术进行受者和供者RHD血型基因分型,对于精确肾移植配型具有重要的临床意义。

产生抗D的DVI type 3型孕妇免疫血清学和RHD基因型分析

目的:对部分D表型孕妇进行免疫血清学和RHD基因型分析。方法:采用常规血型血清学方法鉴定孕妇RhD血型,并进行血型特异性抗体筛查和鉴定;采用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reactionsequence specific primer,PCR-SSP)鉴定孕妇RHD基因型;采用多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA)对孕妇及其配偶和女儿的RhD血型抗原进行基因分型及遗传分析。结果:该孕妇血清中检测出IgG抗-D,其抗体效价为1∶8。PCR-SSP结果显示,该孕妇RHD基因第3-6外显子缺失,经鉴定该孕妇RHD基因型为DVI type 3型。MLPA分析显示,该孕妇只有1条RHD等位基因,且缺失3-6外显子,其基因型为CDVIe/cde,其配偶为CDe/CDe纯合子基因型,女儿为CDe/CDVIe基因型。结论:准确的RhD血型鉴定对制定安全有效的临床输血策略和对育龄妇女采取恰当措施及预防新生儿溶血病具有重要意义。

cis基因交换形成RHD-CE(2～9)-D等位基因

以往通过基因组DNA分析,分别在高加索人和中国人中观察到少数Rh阴性个体存在RHD基因第1和第10外显子,但是该等位基因形成的具体分子机制尚有争论。分别针对RHD基因mRNA的5′和3′非编码区设计一对特异性引物,通过逆转录PCR(RTPCR)和cDNA测序,分析2例RHD基因阳性(拥有第1和第10外显子)、D抗原表型阴性个体的全长mRNA/cDNA序列,同时以1例正常Rh阳性个体(CcDDee)作对照。结果正常Rh阳性个体拥有正常RHD基因mRNA,2名携带RHD基因的Rh阴性个体则均检出存在与正常RHD基因或RHCE基因转录产物相同长度、以及相同外显子构成的mRNA,但该转录子的第1和第10外显子及3′非编码区序列与RHD基因一致,而第2～9外显子全部序列与RHCE(e)基因mRNA相同,表明2名个体均存在RHDCE(2～9)D融合RHD等位基因,即其RHD基因的第2～9外显子被同源RHCE(e)基因替换,导致不能编码正常RhD蛋白,形成个体D抗原阴性表型。

中国人群真实RhD阴性个体和RhD^(el)型RHD基因研究

为观察中国人群真实 Rh D阴性个体和 Rh Del型 RHD基因存在情况 ,采用常规盐水法和抗人球蛋白试验筛选 Rh D阴性捐血者 ,通过吸收放散试验确定其中 Rh Del和真实 Rh D阴性 ,并采用 PCR技术检测 RHD基因第 4内含子 ,对吸收放散试验结果与基因检测结果不符的样本进一步采用序列特异性引物 PCR (PCR- SSP)技术测定 RHD基因第3、 4、 5、 6、 7、 9和 10外显子 ,观察基因变异。筛选获得 10 4名 Rh D阴性捐血者 ,吸收放散试验鉴定 2 5名 (2 4 .0 % )为 Rh Del型 ,79名 (76 .0 % )为真实 Rh D阴性 ;2 5例 Rh Del全部检测到 D基因 exon4 - intro4 - exon5区域 ,79名真实 Rh D阴性个体中有 5名 (6 .3% )个体 (2名 CCdee,2名 ccd Ee,1名 Ccdee)检测到 D基因第 4内含子 ;PCR- SSP结果显示5名个体中 ,4名存在全部被检测的 D基因区域 ,1名个体 (ccd Ee)第 5外显子检测阴性。结果表明抗人球蛋白试验确认的 Rh D阴性中国人中存在高比率的 Rh Del型 ,且均可检测出 RHD基因第 4内含子 ;若排除 Rh Del,携带 D基因的 Rh D阴性中国人的比率明显降低 ,且这些个体并非如以往报道的均为

甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD(+)血型的初步研究

Rh血型与ABO血型一样是重要的血型系统 ,Rh血型不符会引起严重的输血反应及新生儿溶血病。中国人群中RhD阴性血型的比例仅为 0 .2 % - 0 .5 % ,将RhD阳性红细胞改造成RhD阴性红细胞在临床输血中有重要的意义。本研究用 4种不同端基的甲氧基聚乙二醇 (mPEG) ,修饰A型、B型、AB型和O型的RhD( + )红细胞 ,比较 4种mPEG衍生物对RhD抗原的修饰效果。同时观察mPEG修饰对红细胞形态、结构和功能的影响。结果表明 ,mPEG BTC(苯并三唑端基PEG)较其他 3种PEG的修饰效果好 ,在 1mmol/L时可以有效地遮蔽红细胞表面RhD抗原 ,而对红细胞形态、渗透脆性、自身溶血、乙酰胆碱酯酶、胆固醇、ATP、2 ,3 DPG含量以及变形性无影响。结论 :初步实现了将RhD( + )红细胞修饰改造成RhD( - )红细胞的目的。

RhD阴性红细胞临床用血情况调查与分析

目的了解供血医院红细胞临床用量的血型分布特点,以指导血站RhD阴性血液库存管理,保障临床用血。方法调查2007-2015年本中心红细胞类血液制剂临床供应量,统计分析RhD阴性血用量特点、RhD阴性红细胞临床供应及调剂情况。结果 2007-2015年本中心供应给临床的红细胞由2007年的78 808 U增长至2015年的121 234.5U。9年间,RhD阴性红细胞用量由509.5 U增长至963 U,年均增长率为8.88%;年度RhD阴性红细胞用量所占比例为0.62%-0.79%(CV=9.9%),其中解冻红细胞用量占9.9%-21.2%,临床调剂量在4.4%-9.6%。结论本中心供应临床的RhD阴性红细胞用量比例高于RhD阴性人群分布比例,需进一步加强血站-医院RhD阴性血液管理,合理调配RhD阴性血液资源。

福建省RhD阴性个体RHD基因多态性

为了探讨RhD阴性福建个体的RHD基因结构，设计14对序列特异性引物，应用PCR—SSP技术检测104名福建省RhD阴性献血者的RH基因型，并对部分样本进行吸收放散试验，同时对2例携带RHD基因RhD阴性样本进行DNA序列测定。结果显示，61．54％阴性福建个体完全缺失RHD基因（RHD^-／RHD^-），25．97％RhD携带RHD1227A等位基因（其中62．96％为RHD^＋／RHD^-杂合子，37．04％为RHD^＋／RHD^＋纯合子），8．65％携带RHD-CE（2—9）-D等位基因，1．92％携带RHD710delC等位基因；多数RHD基因缺失存在于dce单倍体中，发现6例RHD基因缺失存在于dCe单倍体（RH基因型为dce／dCe）中，2例存在于dcE单倍体（RH基因型为dce／dcE）中；同时检测8个RHD基因外显予以及RHD1227A等位基因，以预测RhD表型的准确性明显高于单独检测某个RHD基因外显子的准确性（Χ^2=24．43，P〈0.005）。结论：RhD阴性福建个体RHD基因具有多态性；在中国用RHD基因分型完全替代血清学检测RhD表型的条件尚未成熟。

海南汉族RhD阴性个体RHD基因研究

目的探讨海南汉族Rh阴性献血者的RHD基因结构,为建立适合本群体的正确的RHD基因定型方法提供依据。方法采用常规盐水法和抗球蛋白法筛选RhD阴性献血者,通过吸收放散试验确定其中RhDel,并采用PCR SSP技术分析其RHD基因存在情况,对存在全部外显子的个体进一步检测RHD内含子2、10和RHDψ假基因。结果筛选获得的106名RhD阴性个体中,31例(29.25%)为RhDel,存在完整RHD基因;剩下75例中,67例(63.21%)完全缺失RHD基因,8例缺失部分RHD基因;存在全部外显子的31例RhDel个体均存在RHD内含子2、10而无RHDψ基因。另外,在1例ccdEe样本中检测到外显子1、3、4、6、7、9及10,仅缺少外显子5。结论海南汉族RhD阴性群体中存在高比率的RhDel,且所有RhDel样本均可检测到全部的RHD基因外显子;海南汉族真实RhD阴性个体的RHD基因呈多态性,缺失部分RHD基因的个体均未检测到RHD外显子5,提示对本群体而言,特异性扩增外显子5在RHD基因定型中具有重要意义。

表型为CC或Cc19名RhD(-)中国无关供血者中的RHD基因多态性

目的：探讨ＲｈＤ（－）中国无关供血者中ＲＨＤ基因的基因构成情况。方法：采用ＰＣＲ－ＳＳＰ方法对３４名ＲｈＤ（－）的中国供血者的基因组ＤＮＡ进行研究。主要扩增ＲＨＤ基因外显子２、３、４、５、６、７、９、１０和内含子４以及ＲＨＣＥ基因内含子４。结果：３４名ＲｈＤ（－）中国供血者的ＲｈＣｃＥｅ表型为４例ＣＣｅｅ，１５例Ｃｃｅｅ和１４例ｃｃｅｅ及１例ｃｃＥｅ。在所有表型为ｃｃｅｅ或ｃｃＥｅ的１５例ＲｈＤ（－）个体中，ＲＨＤ基因完全缺失；而在表型为ＣＣｅｅ或Ｃｃｅｅ的１９例ＲｈＤ（－）个体中，ＲＨＤ基因则表现出多态性：８名供血者存在大量正常的ＲＨＤ基因，占４２．１１％；７名供血者表现为部分缺失，占３６．８４％；４名供血者则完全缺失ＲＨＤ基因，占２１．０５％。其中，７名部分缺失均为同一中间缺失，只存在外显子１、２和３非编码区。ＲｈＤ（－）个体携带或部分携带ＲＨＤ基因的表型为ＣＣｅｅ或Ｃｃｅｅ，而无ｃｃｅｅ。结论：在表型为ＣＣ或Ｃｃ的中国供血者中观察到３种ＲＨＤ基因多态性，提示ＲｈＤ（－）个体携带或部分携带ＲＨＤ基因与ＲｈＣ阳性之间有某种关系。因此，将ＲＨＤ基因定型结果应用于临床医学时应特别注意。

中国人特异性的RHD基因定型方法的建立

目的 建立特异性针对中国人的RHD基因定型方法。方法 设计6对特异性针对中国人RHD等位基 因的引物,并引入1对内对照引物,建立PCR 序列特异性引物(PCR- SSP)方法,分6个反应管检测RHD基因。采 用这一方法检测经血清学鉴定和RHD全基因序列分析的88份中国汉族人Rh阴性样本,13份Rh阳性、弱D型和 部分D表型样本,以及28份D放散型(Del)样本,同时对318名随机无偿献血者作RHD基因定型,然后与血清学检 测结果比较。结果 所有样本的PCR SSP检测结果均与血清学结果一致(符合率100%),并可指示目前在中国人 中观察到的全部RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因(或称无效等位基因),同时还可检出Del表型及存在于Rh阳 性个体中的Del等位基因(RHD1227A)即RHD/Del杂合型(或RHD/RHD1227A);对318名随机个体的RHD 基因检测显示后者在中国人群中的比例为8/318,Del基因在中国人群中频率即为0.012579。结论 上述PCR-SSP 方法简便、快速,且具有较高的准确率,可用于临床或科研进行中国人RHD基因定型或遗传分析。