RhD mRNA剪接体全长外显子序列扩增技术的应用

目的探讨建立的RhD mRNA剪接体多态性检测技术的有效性与实用性。方法采用设计的两对引物扩增全长RhD mRNA外显子,完全避开RHCE基因的干扰,特异性扩增并分析了随机选取的非血缘关系50例标本的RhDmRNA剪接情况。结果两对引物能扩增RhD mRNA剪接体的全长外显子基因并分析出RHD基因剪接体的多态性,扩增出4种剪接体的特异性:exon-1-3扩增产物:415 bp;exon-3-10扩增产物均由3种不同组合构成:产物一:约880 bp,产物二:约750 bp;产物三:约550 bp。50例标本:exon-1-3扩增产物:全部无缺失;exon-3-10扩增产物:带1无缺失,带2缺exon-7的占总标本27例、缺exon-7,8的占总标本6例、缺exon-8,9的占总标本12例、缺exon-7,9的占总标本5例,带3全部缺exon-7,8,9。结论建立的RhD mRNA剪接体多态性检测技术可以准确扩增RhD mRNA全长基因,并有效分析该基因剪接体的多态性。

替代剪切形成多种形式的RhD mRNA

目的 探讨RHD基因转录后是否存在因替代拼接形成不同形式的mRNA。方法 采用逆转录PCR(RT PCR)技术检测 4名不同Rh表型 (CcDDEe、CCDDee、CcDDee和ccDdee)个体的RhDmRNA ,然后进行cDNA测序分析。结果 不同Rh表型的个体有相同的和复杂的RhDmRNA形式 ,均存在正常形式的RhDmRNA ,以及缺失第 7、第 9、第7和 9、第 7～ 9外显子共 5种形式的RHD转录子 ,这些缺失外显子的转录子的其余序列与正常RhDmRNA完全一致 ,显示 RHD 基因转录后存在替代剪切机制 ,且发生在第 7 8 9外显子或内含子区域。结论 RHD 基因因为替代剪切第 7、8、9外显子形成复杂的、不同外显子组合的基因转录子 ,因此可能翻译成氨基酸C 端互不相同的多种形式的蛋白质。

RHD mRNA剪接体与RhD抗原表达的相关性及其在输血及妊娠中的免疫应答研究

目的通过探讨RHD mRNA剪接体多态性与RhD抗原表达的强度在临床输血、妊娠中的异常免疫应答,为RhD血型定型标准与输血原则提供理论依据。方法选择案例1:RhD阳性(血清学凝集强度达4+)的男性患者因为多次输RhD阳性血合并自身免疫性疾病,血浆中产生了抗-D。案例2:RhD弱阳性孕妇怀孕RhD阳性胎儿产生了抗-D。案例3:Rhccdee表型的地贫患儿因长期(8年)输注常规定型为RhD阴性的血液后产生了抗-D。以上3例样本提取全血的mRNA通过反转录成cDNA,使用RT-PCR法通过自主设计的引物进行扩增测序与分析RHD mRNA剪接体的多态性结构。结果所选的3例患者中患者1、患者2均以3种剪接体的多态性表达了RHD基因。患者1的RHD mRNA剪接体形式:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,并且在exon-3的第426位发生C>A突变、exon-5的707位发生A>G突变、713位发生T>C突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;患者2的RHD mRNA剪接体:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-8,9,未发现其他核苷酸突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;因为患者3是RhD阴性,缺失RHD基因全部外显子,因此未检测到RHD mRNA剪接体的多态性。结论 RhD抗原的表达直接受RH基因调控,RhD mRNA剪接体的多态性决定RhD抗原强度的差异。RhD抗原弱阳性或阴性的受血者在接受RhD阳性血液时也受同种异体免疫产生抗-D的风险。

RhD mRNA缺失型剪接体编码蛋白质表达的研究

目的观察RhD mRNA缺失型剪接体编码蛋白质在RhD阳性红细胞表面表达情况。方法使用序列特异引物聚合酶链反应检测RhD阳性红细胞mRNA剪接体类型,通过生物信息分析工具分析不同剪接体编码蛋白质胞外区多肽氨基酸顺序的差异并定制抗体。使用定制抗体检测缺失型剪接体编码蛋白质在红细胞表面表达情况。结果 RhD阳性个体主要存在3种不同RhD mRNA剪接体:包含RHD 10个外显子的全长剪接体、缺失第7外显子和缺失第7/8/9外显子的剪接体,其出现频率分别为100%、85.19%和96.30%(n=27)。胞外区多肽差异出现在胞外5区,定制抗体流式检测结果显示RhD阳性红细胞荧光强度高于RhD阴性红细胞荧光强度。结论缺失第7外显子及缺失第7/8/9外显子剪接体编码蛋白质均在红细胞表面有所表达。

野生型RhD mRNA全长剪接体多态性分析

目的通过对野生型RhD mRNA序列分析,研究其变异产生规律及其编码的氨基酸变化情况。方法采用两段拼接的方法设计RhD mRNA扩增引物以避免RhCE mRNA的干扰,通过PCR-SSP及基因测序检测了27份随机选取的无亲缘关系无偿献血者样本,分析其RhD mRNA基因突变频率及氨基酸表达变化情况。结果所有标本中均含有由RHD 10个外显子组成的RhD mRNA全长剪接体,且存在22种点突变,其中11处点突变可导致氨基酸序列发生改变,667T>G(2/27,7.41%)、697G>A(1/27,3.70%)两处点突变导致223F>V、233E>K氨基酸的改变发生在胞外区,其余氨基酸改变发生在胞膜或胞内区。结论野生型RhD mRNA全长剪接体序列及其编码的氨基酸具有多态性。

RhD放散型相关的等位基因的鉴定

目的 :为了探讨D放散型 (Del)表型的分子基础。方法 :采用序列分析方法分析 2 6名Del表型个体RHD基因全长编码区和一名个体的RHD基因第 7内含子部分序列 ;同时使用血清学方法检测全部个体的RhCcEe表型。结果 :全部样品的第 9外显子均存在RHD 12 2 7G >A碱基突变 ,其余序列则与正常RHD基因一致 ,一名个体的第 7内含子观察到一处碱基突变RHDIVS7+15 2c >a ;血清学结果显示所有Del表型个体均为RhC抗原阳性个体。结论 :由于 12 2 7A位于RHD基因第 9外显子与第 9内含子交界处 ,可能影响前RNA转录后mRNA的正常拼接 ,形成Del表型。

RHD mRNA替代剪接区域研究

目的2007年国内报道一例弱D型个体存在第4—9外显子选择性剪接的转录子，我们探讨正常Rh（D）阳性个体的RHD基因mRNA的选择性剪接区域。方法随机选择3名Rh（D）阳性个体，从新鲜全血中提取总RNA，通过特异性引物，采用“一步法”逆转录-PCR（1iT—PCR），扩增RHDmRNA第1～7外显子区域，以及第6-10外显子区域，然后cDNA琼脂糖凝胶电泳和成像分析。结果未发现第1～7外显子区域存在mRNA的选择性剪接条带，仅存在由特异性引物所扩增的第1—7外显子全长的序列条带；而第6～10外显子区域观察到5种替代剪切条带，序列分析显示分别为无缺失片段，以及完整缺失第7、第9、第7和9、第7—9外显子5种RHD转录子。结论正常Rh（D）抗原阳性个体的RHD基因mRNA的选择性剪接仅存在于第7～9外显子区域。