努比亚山羊Rheb基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建

【目的】研究旨在对努比亚山羊大脑富集Ras同源物(Ras homolog enriched in brain,Rheb)基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体,为进一步揭示Rheb对努比亚山羊骨骼肌调控的分子机理奠定基础。【方法】试验采用RT-PCR方法从努比亚山羊背最长肌组织中扩增Rheb基因,经琼脂糖凝胶电泳及测序验证正确后进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,转染细胞后进行实时荧光定量PCR检测来验证所构建载体的正确性。【结果】努比亚山羊Rheb基因编码区序列长度为555 bp,编码184个氨基酸,Rheb蛋白分子式为C 910 H 1456 N 236 O 279 S 6,分子质量为20359.34 u,原子总数为2887,理论等电点为5.93。Rheb蛋白属于稳定的亲水性蛋白,不包含跨膜结构域。蛋白二级结构预测结果显示,努比亚山羊Rheb蛋白中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占40.76%、7.07%、22.83%和29.35%。构建的真核表达载体pcDNA3.1-Rheb转染山羊骨骼肌细胞后,与空载体组相比,Rheb基因表达量极显著升高(P<0.01)。【结论】本试验成功克隆努比亚山羊Rheb基因编码区序列,并构建pcDNA3.1-Rheb真核表达载体,这为深入理解Rheb基因在努比亚山羊肌肉中的作用提供了理论支持。

团头鲂Rheb基因分子特征及其对氨氮胁迫的响应

【目的】探究团头鲂Rheb基因分子特征及其对氨氮胁迫的响应,为明确氨氮胁迫通过Rheb蛋白介导的通路调控鱼类生长机制及后期药物定点治疗提供理论依据。【方法】以团头鲂幼鱼为研究对象,采用c DNA末端快速扩增(RACE)克隆团头鲂脑组织中Rheb基因cDNA序列,对其进行生物信息学分析及构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR检测Rheb基因在团头鲂不同组织中的表达模式。设氨氮胁迫组和对照组,通过曲线拟合计算氨氮胁迫下团头鲂的96 h半致死浓度(96 h-LC_(50)),对末重和特定生长率(SGR)进行组间显著性检验。【结果】Rheb基因c DNA序列全长1488 bp,其中5’和3’端非编码区(UTR)分别为245和688 bp,开放阅读框(ORF)为555 bp,共编码184个氨基酸残基。Rheb蛋白的平均亲水性指数为-0.196,表明Rheb为亲水性蛋白;其二级结构中,α-螺旋占38.59%,延伸链占20.11%,β-转角占6.52%,无规则卷曲占34.78%。基于Rheb蛋白氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,团头鲂与同科的斑马鱼聚为一支,而与软体动物(虾夷扇贝和美洲牡蛎)及节肢动物(拟穴青蟹和三疣梭子蟹)的亲缘关系较远。团头鲂96 h-LC_(50)的氨氮浓度为54.45 mg/L;与对照组相比,氨氮胁迫下团头鲂的末重和SGR显著降低(P<0.05,下同);胁迫组Rheb基因的相对表达量显著低于对照组。【结论】Rheb蛋白存在于团头鲂各组织中,其中脑组织中含量最高,长期氨氮胁迫能降低团头鲂的生长指标和Rheb基因表达水平,推测Rheb蛋白是通过某种信号通路参与氨氮胁迫下团头鲂体重的调控。

血管内皮细胞敲除Rheb基因杂合子小鼠模型建立及意义

目的建立血管内皮细胞敲除Rheb基因杂合子小鼠模型,旨在进一步研究Rheb基因在胚胎血管形成中的作用。方法将5只Rheb^(flox/flox)雄鼠与15只Rheb^(flox/+)雌鼠进行交配,共繁殖出子代小鼠76只(基因型为Rheb^(flox/flox)或Rheb^(flox/+))。将76只子代小鼠与20只血管内皮细胞特异性表达Tek-Cre重组酶的小鼠(以下称Cre小鼠)进行交配,得到基因型为Tek-Cre×Rheb^(flox/+)及单纯Rheb^(flox/+)子代小鼠共140只。采用PCR法对140只小鼠鼠尾组织Rhebflox及Tek-Cre基因型进行鉴定,并记录其2月龄体长及体质量;采用Western blotting法检测Tek-Cre×Rheb^(flox/+)小鼠与单纯Rheb^(flox/+)小鼠肝组织Rheb蛋白表达。结果共得到基因型为Tek-Cre×Rheb^(flox/+)小鼠72只、单纯Rheb^(flox/+)小鼠68只,其体长分别为(18.50±0.13)、(18.80±0.10)cm,体质量分别为(29.50±0.15)、(30.10±0.21)g,二者比较P均>0.05;肝组织Rheb蛋白相对表达量分别为0.21±0.17、0.66±0.12,二者比较P<0.05。结论成功构建血管内皮细胞敲除Rheb基因杂合子小鼠模型,将为研究Rheb基因在胚胎血管形成中的作用奠定基础。