快生型大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)内源质粒在培养及共生过程中的稳定性

以湖北洪湖公离的快生型大豆根瘤菌为材料，考察了它们的内源质粒在培养过程及共生过程中的稳定性．结果表明，所有供试菌株的质粒在培养条件下比较稳定，传代50次后没有明显变异．对其中2个菌株与4种不同的大豆宿主共生过程中质粒的稳定性研究，发现HA12－1－12的共生质粒和隐性质粒高度构定，HA7－2－2的质粒却发生了不同程度的变异．质粒检测的结果及RFLP分析表明，HA7－2－2共生质粒的稳定性高于隐性质粒，而且共生质粒上携带的nodDABC和nifHDK基因相当保守，不易受宿主的影响而产生变异．盆栽试验的结果也说明，虽然HA7－2－2的内源质粒在共生过程中发生了遗传重排，但它的共生性状没有明显的变异．

快生型大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)15067与褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)10006的16S rDNA分析

分别对快生型大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)15067和褐球固氮菌(Azotobacter chroococ-cum)10006两个菌株进行了16S rDNA的全序列测定,将此全序列与已知相关的16S rDNA进行了比较及聚类分析,得到系统发育树状图。在系统发育树中,根瘤菌15067隶属于中华根瘤菌属,与Sinorhizobium xinjiangenseIAM 14142,SinoRhizobium frediiSjzZ 4构成一个分支,其中与S.frediiSjzZ4的相似性最高,达99.72%;固氮菌10006处于固氮菌属分支中,其中和Azotobacter chroococcumAM12A,Azotobacter chroococcum的相似性均高达99.93%。为确定两株菌株的分类地位、进一步发掘和利用菌株的优良性状提供了参考依据。

费氏中华根瘤菌042BS(Rhizobium fredii 042BS)蛋白质组学初步研究

为了从蛋白质水平阐明根瘤菌的固氮机理,扩大其宿主植物范围,应用蛋白质组学技术(2-DE),分析比较了能够在大豆和苜蓿上跨宿主结瘤的费氏中华根瘤菌042BS与已经完成基因组测序的根瘤菌模式菌株苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti 1021)的蛋白质表达图谱差异。经过图像分析检测到二者分别有436和428蛋白点。其中约有50个蛋白点初步认为二者所共有的。

应用发光酶基因对快生型大豆根瘤菌HN01结瘤作用进行检测

含发光酶基因luxAB的Tn5转座子自杀质粒pHNC3，在辅助质粒pRK2013的帮助下，转入快生型大豆根瘤菌HN01中小，pHNC3经自杀重组，其Tn5－luxAB转座插入HN01基因组中，从而赋予HN01以发光活性。挑取具有发光活性的HN01杂交单菌落，进行质粒快检和以luxAB为探针的分子杂交，选取Tn5-luxAB分别插入到HN01染色体上和不同质粒上的标记菌株，进行灭菌盆栽实验，并对一株Tn5-luxAB标记于染色体上的菌株HN01LC02进行了模拟大豆栽培条件下的有菌盆栽实验，包括对发光根瘤菌占瘤率的测定和发光根瘤在根系上分布情况的测定。

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．

基模势对luxAB标记的快生型大豆根瘤菌在土壤中存活的影响

经接合转移将luxAB基因插入快生型大豆根瘤菌 (Rhizobiumfredii)染色体 ,取可高效结瘤固氮的R .frediilux3菌株用于分子生态学研究 .在不同基模势下 ,研究了lux3在土壤中的存活 ,基模势为 - 30和 - 750kPa时 ,lux3在灭菌土中的生存能力明显 (P<0 .0 5)高于未灭菌土 ,当基模势为 - 1 50 0kPa时 ,土壤是否灭菌对lux3的存活影响没有差异 .不同基模势对lux3活性影响显著 ,在 - 1 50 0kPa的未灭菌土中 ,随着饥饿时间延长 ,可恢复活性的细菌数量显著下降 .同时比较了测定微生物活性的 3种方法 (即生物发光、脱氢酶活性和微生物呼吸 ) ,发光值变化与活细胞密度变化一致 ,PLf值 (即潜在发光 ,Potentialluminescence)反映了可恢复活性的饥饿种群密度 .

洪湖市土壤中快生型大豆根瘤菌的多样性

从湖北省洪湖市土壤中分离纯化了９２株快生型大豆根瘤菌。用来自８个取样地点的１２个快生型典型菌株和１个慢生型菌株的抗血清检测了该快生型大豆根瘤菌群体的抗原构成。其中６５株菌归入１５个血清型，２０．７％属于ＵＳＤＡ２０５型，１５．２％为Ａｄ３０１（１）型。有２７株不与已知抗血清反应，为未知的血清型。对供试菌株质粒进行的快速检测结果表明，各菌株均含有２～６个质粒，其中最大的质粒在５００Ｍｄ左右。含４个质粒的菌株最多，含５～６个质粒的菌株较少。根据质粒图谱分析，洪湖快生型大豆根瘤菌可分为１１个质粒型．菌株的质粒型与血清型之间无明显相关性。

用叶绿素含量评价快生型大豆根瘤菌的共生有效性

生长在氮素含量分别为０、７５、１５０、３００和６００ｍｇ／钵下的盆栽大豆，其植株叶片的叶绿素含量与植株干重（ｒ＝０．９３，Ｐ＜０．０１）、植株全氮量（ｒ＝０．８７，Ｐ＜０．０１）显著相关。在与之平行的试验中，当共生有效性不同的快生型大豆根瘤菌分别接种于栽培大豆后，植株叶片的叶绿素含量与植株干重（ｒ＝０．９８，Ｐ＜０．０１）、植株全氮量（ｒ＝０．８９，Ｐ＜０．０１）和根瘤的固氮酶活性（ｒ＝０．９５，Ｐ＜０．０１）也存在显著的相关性。利用叶绿素含量对供试快生型大豆根瘤菌共生有效性进行评估的结果与用植株全氮量的结果相似。研究证明可以用叶绿素含量来间接指示大豆植株的含氮量及根瘤菌的共生有效性。

大豆根瘤菌HH103菌株培养基的筛选与优化

以快生型大豆根瘤菌HH103菌株为供试菌株,采用单因素碳氮源利用试验和正交设计试验,确定最佳培养基及其配方。结果表明:该菌株在YMA中生长良好,最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母膏,最佳培养基成分配方(g/L):蔗糖11,酵母膏0.9,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.005,CaCl2 0.1,KH2PO4 0.5,MgSO4 0.2,KNO30.77,(NH4)2HPO4 0.33,FeCl3 0.005,pH 7.2。

应用luxAB基因和gusA基因标记大豆根瘤菌的效果

应用发光酶基因ｌｕｘＡＢ和β－葡萄糖苷酶基因ｇｕｓＡ分别对快生型大豆根瘤菌ＨＮ０１进行了标记，研究了这两种标记系统的检测方法和检测效果，并对这两种标记系统在大豆根瘤菌中的应用进行了分析比较。

不同土壤类型中大豆根瘤菌解磷能力及其稳定性评价

为准确评价大豆根瘤菌解磷能力在不同土壤环境中的稳定性和适应性,筛选在黑龙江省多种土壤类型中具有高效解磷能力的大豆根瘤菌,分析前期分离、鉴定获得的10株大豆根瘤菌菌株在不同土壤类型条件下的磷解能力,并采用GGE双标图法分析评价解磷能力的稳定性。结果表明:以黑土作为“磷溶出库”,接种菌株113-2、112-1、114-2、111-2、114-1和115-2的培养基上清液无机磷含量显著高于无接种对照处理,提高幅度为0.68%~7.02%;以草甸土作为“磷溶出库”,接种菌株112-1、113-2、114-2、115-2、114-1、111-2、113-1和111-1的培养基上清液无机磷含量显著高于对照处理,提高幅度为0.57%~8.25%;以黑钙土作为“磷溶出库”,接种不同根瘤菌处理的培养基上清液无机磷含量均显著高于对照处理,提高幅度为0.75%~7.0%;以白浆土作为“磷溶出库”,接种菌株112-1、113-2、114-2、111-2、115-1、114-2、111-1和112-2的培养基上清液无机磷含量显著高于对照处理,提高幅度为0.41%~14.8%;以盐碱土作为“磷溶出库”,接种菌株113-2、112-1、114-2、111-2、114-1、115-2和113-1的培养基上清液无机磷含量显著高于对照处理,提高幅度为0.47%~9.9%。以黑土、草甸土、黑钙土、白浆土和盐碱土作为“磷溶出库”接种处理的土壤有效磷含量较对照处理分别提高0.07%~21.53%、0.08%~38.82%、0.07%~25.94%、0.27%~17.40%和0.34%~34.71%。GGE双标图数学模型综合对比得出土壤磷活化能力强且稳定性较好的菌株为112-1、113-2和114-2。

土壤中质粒pLV1016在快生型大豆根瘤菌间的水平转移

在滤膜、液体培养基和土壤微宇宙 3种系统中 ,研究了接合型质粒 pLV1 0 1 6由快生型大豆根瘤菌 (Rhizobiumfredii)QB1 1 31向R .frediilux3的水平转移及pLV1 0 1 6由QB1 1 31向土著细菌的转移 .接合培养 1d后 ,分别计算供、受体菌的生长速率和质粒转移速率常数 (γ) .结果表明 ,相同接种浓度下 ,滤膜接合时γ值最高 ,土壤中γ值最低 ,γ值不受土壤是否灭菌和是否有大豆植株的影响 ,γ值与初始接种浓度负相关 ,与供、受体的生长速率正相关 .在未灭菌土中检测到 pLV1 0 1 6可转移到土著细菌 ,土著接合子分别属于根瘤菌属和假单胞菌属 .

周口地区大豆根瘤菌的分离与分子鉴定

为了进一步研究发掘新的根瘤菌资源库,采用平板划线分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌,并且将获得的菌株进行盆栽回接试验,结果表明,分离获得的大豆根瘤菌菌株均可在大豆和苜蓿上结瘤,具有结瘤能力。根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nod A、nif H、16S r DNA保守区域设计引物,并且对nod A、nif H、16S r DNA序列进行扩增分析和系统发育分析,由此鉴定分离的根瘤菌为费式中华根瘤菌,从而在分子水平上实现了对大豆根瘤菌的快速鉴定。

快生型大豆根瘤菌基因库的构建

本文报道了用柯斯质粒(cosmid)pLAFRI 作为载体,通过 EcoRI 部分酶切快生型大豆根瘤菌的全部 DNA,获得“目的”DNA 片段,用大肠杆菌 ED8767作为受体菌株,我们构建了一株快生型大豆根瘤菌——B52菌株的基因库。插入的基因片段大小为20～30kb,所获得的抗性菌落数为3.9×10~4,其中外源基因插入频率为70%,重组子数超过“理论”值,达到了希望的建库要求。

不同基模势下luxAB标记的弗氏中华根瘤菌在土壤中的存活能力

经接合转移将luxAB基因插入弗氏中华根瘤菌 (Rhizobiumfredii)染色体 ,取可高效结瘤固氮的R .frediilux3菌株用于分子生态学研究 .在不同基模势下 ,研究了lux3在土壤中的存活 ,基模势为 - 30和 - 75 0kPa时 ,lux3在灭菌土中的存活能力明显 (P <0 .0 5 )高于未灭菌土 ,当基模势为 - 15 0 0kPa时 ,土壤是否灭菌对lux3的存活影响没有差异 .不同基模势对lux3活性影响显著 ,在 - 15 0 0kPa的未灭菌土中随着饥饿时间的延长 ,可恢复活性的细菌数量显著下降 .比较了测定微生物活性的 3种方法 (即脱氢酶活性、生物发光和微生物呼吸 ) ,发光值变化与活细胞密度变化一致 .图 4表 2参

快生型大豆根瘤菌G113的几个共生特性

快生型大豆根瘤菌G113是从吉林省、公主岭黑土上生长的野生大豆G3的根瘤中分离获得。野生大豆G3在有快慢生型大豆根瘤菌同时存在时,选择G113和其共生。G113菌株和吉林20大豆共生优于轻碱土中的土著大豆根瘤菌。因此在轻碱土上、吉林20大豆接种G113菌株有增产趋势。

AMF与根瘤菌对间作大豆光合与呼吸代谢的影响

为探索接种幼套球囊霉Glomus etunicatum(简写为A)和费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii(简写为R)对金橘Fortunella margarita(Lour.)Swingle(简写为F)/大豆Glycine max(简写为S)间作系统中大豆植株生长的影响,本文通过田间试验,分析间作系统中各处理大豆的光合与呼吸代谢及植株生长发育状况。结果表明:1)所有间作处理的大豆根系菌根侵染强度η_(m)和根系泡囊强度η_(V)均比相应的单作处理低,各相对应处理间η_(m)差异均显著,η_(V)差异均不显著(除间作双接种处理较单作双接种处理η_(V)显著增加外)。与相应的S或F+S对照相比,所有单接种A或单接种R处理分别表现出显著或不显著的促进效应,而双接种处理的增加效应最大且差异显著。2)间作F+S处理的大豆根瘤数量和干质量均比相应的单作S处理低,但分别单接种A或R处理后,均呈增加趋势;单作系统和间作系统中,双接种A+R处理的促进效果最显著。3)间作系统中,F+S处理的大豆叶片叶绿素含量和净光合速率均比相应的单作S处理低,分别单接种A或R后均呈升高趋势,双接种处理的促进效果优于单接种处理,间作双接种处理的净光合速率最高。4)间作系统的大豆叶片琥珀酸脱氢酶活性高于相应的单作处理,接种处理的促进效果由大到小均为双接种A+R、单接种A、单接种R。5)大豆叶片线粒体膜H^(+)-ATP酶活性的变化趋势与净光合速率的变化趋势相似。6)各间作接种处理的大豆生物量及产量均高于其相对应的单作接种处理,且各间作接种处理均有A+R>A>R的促进趋势。可见,幼套球囊霉和费氏中华根瘤菌双接种处理可显著促进间作大豆植株生长,促进效应优于单接种处理。

大豆根瘤菌8－1－4A色氨酸营养缺陷突变型的筛选及其原养型回复突变株共生效率的研究

采用转座子Ｔｎ５诱变快生型大豆根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）８－１－４Ａ筛选到１０个色氨酸营养缺陷型突变株，植物结瘤试验表明这些菌均失去了结瘤能力。经自发突变，从培养平板和振瘤中分离出２３个色氨酸原养回复突变株，盆栽试验结果表明有２２株的结瘤能力得到恢复，其中有５株的共生效率与出发菌相比有显著提高。对部分回复突变株进行了质粒检测和以标记Ｔｎ５为探针的ＳｏｕｔｈｅｒｎＤＮＡ杂交分析。

两个重组质粒在快生型大豆根瘤菌中的稳定性的比较

将两个复制子（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）相同的重组质粒导入快生型大豆根瘤菌中，考察了得到的转移接合子在培养和共生条件下的稳定性。发现带有质粒ＲＫ２ｐａｒ基因的重组质粒ｐＴ２ＴＸ３Ｋ在快生型大豆根瘤菌中无论在培养还是共生条件下都可以稳定存在，而不带有该基因的重组质粒ｐＣＫ３在两种条件下都有一定程度的丢失。